家蠶血細(xì)胞特異啟動(dòng)子的篩選與鑒定.pdf

1、家蠶是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的鱗翅目模式生物，在理論研究和生產(chǎn)應(yīng)用方面都具有重要作用。家蠶基因組框架圖、精細(xì)圖和全基因組表達(dá)芯片等研究工作的完成，為家蠶基因的鑒定與功能研究提供了豐富的數(shù)據(jù)資源。家蠶血細(xì)胞在家蠶代謝、先天免疫以及發(fā)育變態(tài)等方面扮演重要角色。盡管眾多有關(guān)家蠶血細(xì)胞的相關(guān)基因已經(jīng)被初步克隆與鑒定，但如何研究和應(yīng)用這些基因仍然是亟待解決的問(wèn)題。家蠶轉(zhuǎn)基因關(guān)鍵理論及技術(shù)體系的構(gòu)建，迫切需要家蠶血細(xì)胞特異表達(dá)啟動(dòng)子作為研究工具，來(lái)實(shí)

2、現(xiàn)對(duì)家蠶血細(xì)胞的深入研究。對(duì)家蠶血細(xì)胞特異啟動(dòng)子的探索有助于血細(xì)胞相關(guān)基因功能的解析以及造血調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的深入研究，為家蠶血細(xì)胞研究體系奠定重要的理論基礎(chǔ)。
　　本研究利用家蠶組織芯片表達(dá)數(shù)據(jù)以及qRT-PCR方法篩選出三個(gè)血細(xì)胞特異表達(dá)基因;并基于家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)分別對(duì)三個(gè)候選基因的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行克隆;使用重組桿狀病毒(rAcMNPV)為基因轉(zhuǎn)移載體并結(jié)合流式細(xì)胞分析技術(shù)，分析候選基因啟動(dòng)子活性并對(duì)其蠶體組織特異性進(jìn)行了驗(yàn)證。主要研

3、究結(jié)果如下:
　　1.家蠶血細(xì)胞特異表達(dá)基因的篩選
　　基于家蠶組織芯片數(shù)據(jù)，通過(guò)qRT-PCR進(jìn)行組織表達(dá)分析，最終篩選得到家蠶血細(xì)胞特異高表達(dá)的3個(gè)候選基因，分別為BmCathepsinO、Bmintegrinβ2、Bm04862。BmCathpsinO屬于半胱氨酸蛋白酶家族，主要參與溶酶體的水解作用;Bmintegrinβ2是家蠶整合素β家族成員之一，參與細(xì)胞表面粘附，并在家蠶細(xì)胞中發(fā)揮免疫功能;而B(niǎo)m04862是一個(gè)

4、未曾報(bào)道的新基因。
　　2.BmCathepsinO啟動(dòng)子的克隆及活性分析
　　基于家蠶基因組數(shù)據(jù)，克隆了BmCathepsinO基因5端約2000bp的側(cè)翼區(qū)啟動(dòng)子pBmCatO2K，利用重組桿狀病毒(rAcMNPV)作為基因轉(zhuǎn)移載體，證明克隆的啟動(dòng)子序列在蠶體具有血細(xì)胞特異性活性。隨后，選擇5個(gè)不同大小的啟動(dòng)子片段pBmCatO1.5K、pBmCatO1K、 pBmCatO0.5K、 pBmCatO0.2K在蠶體進(jìn)行啟動(dòng)

5、子活性分析，結(jié)果表明，該啟動(dòng)子核心區(qū)域位于-80至+76bp，而一段254bp(-333～-80bp)的片段存在組織特異性調(diào)控元件，控制該基因在血細(xì)胞中的特異表達(dá)。
　　3.Bmintegrinβ2基因啟動(dòng)子克隆以及蠶體活性分析
　　從Bmintegrinβ2基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游分別選取了2，3和5Kb啟動(dòng)子片段進(jìn)行了克隆。發(fā)現(xiàn)pBmIntβ22K、 pBmIntβ23K、 pBmIntβ25K在細(xì)胞水平以及蠶體均不能驅(qū)動(dòng)紅

6、色熒光蛋白表達(dá)，表明這3個(gè)啟動(dòng)子無(wú)活性。隨后選取兩個(gè)跨第一內(nèi)含子的啟動(dòng)子pBmIntβ23KIN和pBmIntβ21.5KIN進(jìn)行克隆，兩啟動(dòng)子片段在病毒介導(dǎo)下在蠶血細(xì)胞有一定的啟動(dòng)子活性，在脂肪體和絲腺中無(wú)活性。結(jié)果表明啟動(dòng)子存在于第一內(nèi)含子內(nèi)或該區(qū)域存在增強(qiáng)元件，調(diào)控該基因的血細(xì)胞特異性。
　　4.Bm04862基因鑒定及其啟動(dòng)子研究
　　應(yīng)用RACE技術(shù)獲得Bm04862全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。Bm

7、04862基因開(kāi)放閱讀框819bp，共編碼273個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)其為跨膜蛋白;對(duì)Bm04862蛋白亞細(xì)胞定位表明其聚集在細(xì)胞核膜和部分細(xì)胞質(zhì)中。qRT-PCR結(jié)果表明發(fā)該基因在家蠶血細(xì)胞感染外源大腸桿菌24h后表達(dá)量顯著上調(diào)，推測(cè)該基因參與家蠶免疫防御。對(duì)其啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行克隆得到2194bp片段，病毒介導(dǎo)發(fā)現(xiàn)在BmE-SWU3細(xì)胞、蠶體血細(xì)胞，脂肪體以及絲腺體均能驅(qū)動(dòng)DsRed表達(dá)，細(xì)胞水平流式分析其啟動(dòng)子活性為Pph啟動(dòng)子的4.8倍