PLAP-1在牙周組織中的表達(dá)以及對成骨細(xì)胞分化的影響.pdf

1、背景和目的:牙周膜是圍繞牙根并連接牙根和牙槽骨的致密結(jié)締組織,所含的多潛能間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞等礦化形式的細(xì)胞。但在體內(nèi)正常環(huán)境下,牙周膜為堅韌和富有彈性的結(jié)締組織且終生不被骨質(zhì)化,保持著一種自身穩(wěn)定的動態(tài)變化的過程。這表明預(yù)防牙周膜細(xì)胞(periodontal ligament cells,PDLC)向成骨和成牙骨質(zhì)方向發(fā)展存在一定的機制。
　　 通過對人牙周膜中活性基因表達(dá)譜系的研究,分離到了一種新的基

2、因并將其定義為牙周膜相關(guān)蛋白1(periodontal ligament-associated protein-1,PLAP-1)。PLAP-1是一種新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖,屬于小分子富亮氨酸蛋白多糖(small leucine-rich proteoglycan,SLRP)家族中的一員?，F(xiàn)有研究結(jié)果證實PLAP-1可通過與生長因子相互作用而影響骨與軟骨的形成與分化,與骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及腰椎間盤退變等骨關(guān)節(jié)疾病相關(guān),并作為

3、一個負(fù)性調(diào)節(jié)因子參與牙周組織的分化和礦化過程。
　　 ST2細(xì)胞是從BC8小鼠骨髓基質(zhì)中分離出來的間質(zhì)細(xì)胞,具有多分化的潛能,在成骨條件培養(yǎng)基的誘導(dǎo)下可以向成骨細(xì)胞方向分化。因此,常被用作研究向成骨細(xì)胞分化機制的細(xì)胞學(xué)模型。
　　 鑒于目前尚未見PLAP-1在牙周組織中系統(tǒng)分布的文獻報道,在成骨細(xì)胞分化中的作用也有待闡明,本實驗采用免疫組織化學(xué)和RT.PCR技術(shù),對PLAP-1在正常大鼠牙周組織及牙周膜細(xì)胞中的表達(dá)進行研

4、究;并將逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pBABE-hygro-PLAP-1導(dǎo)入ST2細(xì)胞,使其在ST2細(xì)胞中穩(wěn)定超表達(dá),觀察PLAP-1對ST2細(xì)胞分化的影響,以期為進一步研究其在牙周組織的穩(wěn)定和牙周炎中的作用提供一定的細(xì)胞分子生物學(xué)信息。
　　 材料和方法:
　　 1.PLAP-1在大鼠牙周組織及牙周膜細(xì)胞中的表達(dá)分離正常成年SD大鼠上、下頜磨牙,制備組織切片,采用免疫組織化學(xué)的方法觀察PLAP-1蛋白在大鼠牙周組織中的表達(dá)。在體

5、視顯微鏡下拔除大鼠上、下頜磨牙并刮取牙根面中1/3的牙周膜,采用組織塊法原代培養(yǎng)大鼠牙周膜細(xì)胞,取第三代細(xì)胞用于實驗。分別用免疫細(xì)胞化學(xué)和RT-PCR的方法檢測PLAP-1蛋白和mRNA在體外培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　 2.超表達(dá)PLAP-1對ST2細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化的影響構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pBABE-hygro-PLAP-1,脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)入293T病毒包裝細(xì)胞,用含有PLAP-1病毒的培養(yǎng)液感染ST2細(xì)胞,潮霉素

6、B(Hygromycin B)篩選獲得穩(wěn)定超表達(dá)PLAP-1的ST2細(xì)胞。采用RT-PCR及細(xì)胞免疫化學(xué)的方法檢測PLAP-1 mRNA和蛋白在ST2細(xì)胞中的表達(dá)情況,同時采用體外礦化結(jié)節(jié)形成實驗檢測超表達(dá)PLAP-1在ST2細(xì)胞分化中的作用,以正常ST2細(xì)胞和感染逆轉(zhuǎn)錄病毒空載體的ST2細(xì)胞作對照。
　　 結(jié)果:
　　 1.P LAP-1在大鼠牙周組織及牙周膜細(xì)胞中的表達(dá)免疫組織化學(xué)結(jié)果表明,PLAP-1在牙周組織中強

7、陽性表達(dá)于牙周膜,而在牙骨質(zhì)、牙槽骨、牙齦中未見表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,PLAP-1棕黃色著色定位于細(xì)胞質(zhì)中,胞核染色陰性。RT-PCR結(jié)果顯示,PLAP-1在mRNA水平表達(dá)PLAP-1。
　　 2.超表達(dá)PLAP-1抑制ST2細(xì)胞向成骨方向分化經(jīng)酶切電泳和序列分析測定,逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pBABE-hygro-PLAP-1構(gòu)建成功。RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果證實,轉(zhuǎn)染pBABE-hygro-PLAP-1后的ST2細(xì)胞

8、在mRNA和蛋白水平均有PLAP-1的表達(dá),而轉(zhuǎn)染空載體和正常ST2細(xì)胞中PLAP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)均為陰性。經(jīng)Hygromycin B篩選成功獲得穩(wěn)定超表達(dá)PLAP-1的ST2細(xì)胞。礦化結(jié)節(jié)形成實驗觀察到,感染空載體的ST2細(xì)胞和正常ST2形成礦化結(jié)節(jié)的量明顯多于感染PLAP-1的ST2細(xì)胞(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.在大鼠牙周組織中,PLAP-1特異性表達(dá)于牙周膜中,提示其在正常牙周膜的生理功