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文檔簡(jiǎn)介
1、楊梅(Myrica rubra Sieb.et Zucc.,Myricaceae)是華南亞熱帶常綠果樹(shù),近年來(lái)對(duì)楊梅葉的研究主要集中于從中分離出來(lái)的楊梅黃酮,而對(duì)于楊梅葉原花色素的研究十分有限。原花色素(PAs)是在植物中分布范圍僅次于木質(zhì)素的次生代謝產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果表明楊梅葉富含原花色素,且大部分楊梅葉原花色素為原飛燕草素。由于原花色素為聚合物,存在大量結(jié)構(gòu)相似的同分異構(gòu)體,導(dǎo)致其分離方法十分復(fù)雜,給楊梅葉原花色素的研究帶
2、來(lái)了困難。
本文主要以楊梅葉為研究對(duì)象,按照聚合度的不同分離原花色素,對(duì)其結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行進(jìn)一步分析鑒定,并在此基礎(chǔ)上研究了它對(duì)黑色素生成的抑制作用和對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)機(jī)理。為了楊梅葉原花色素可以更好的應(yīng)用到實(shí)際的加工利用中,本文還研究了外界條件以及常用化學(xué)基質(zhì)對(duì)楊梅葉原花色素穩(wěn)定性的影響。主要的研究?jī)?nèi)容如下:
(1)將楊梅葉通過(guò)80%丙酮萃取,Sephadex LH-20柱純化后得到楊梅葉原花色素的粗提物PCBLs。通過(guò)
3、其核磁共振結(jié)果證明了楊梅葉原花色素主要由表?xiàng)攦翰杷匚嗨狨?EGCG)的結(jié)構(gòu)單元組成。通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定楊梅葉中的原花色素聚合物結(jié)構(gòu),并檢測(cè)出95種可能的結(jié)構(gòu)。此外,運(yùn)用正相液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用鑒定低聚原花色素的可能結(jié)構(gòu),并以此為依據(jù)采用正相制備色譜根據(jù)聚合度分離楊梅葉原花色素,然后運(yùn)用反相色譜-電噴霧離子化質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)一步分析,共鑒定出了20種化合物,包括楊梅葉中新被發(fā)現(xiàn)的7種化合物,其中原花色素四聚體、A型連接鍵和包含
4、兩個(gè)(E)GC和一個(gè)(E)GCG的三聚體的結(jié)構(gòu)都是首次報(bào)道。
將正相制備色譜中純化到的餾分進(jìn)行組合,分為低聚原花色素(OPAs)和高聚原花色素(PPAs)。OPAs是正相制備液相分離得到的僅含二聚體和三聚體的低聚體提取物,PPAs是包含四聚體及以上的多聚體提取物。以O(shè)PAs、PPAs和粗提物PCBLs為實(shí)驗(yàn)樣品,研究其對(duì)黑色素生成和細(xì)胞凋亡的影響。
(2)通過(guò)研究楊梅葉原花色素對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制、對(duì)小鼠B16黑色素
5、瘤細(xì)胞的存活率、細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性和細(xì)胞內(nèi)黑色素含量的影響、抗氧化性以及對(duì)對(duì)蝦黑變的影響,表明了楊梅葉原花色素具備抑制黑色素生成的能力。PPAs雖然對(duì)細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性的抑制能力比OPAs弱,但其對(duì)蘑菇酪氨酸酶的活性,對(duì)細(xì)胞內(nèi)黑色素的含量的影響都比OPAs強(qiáng)。
(3)通過(guò)Hoechst33342 DNA染色和AnnexinⅤ+/PI-染色證明了PCBLs、OPAs和PPAs對(duì)卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞凋亡起劑量依賴(lài)性的誘導(dǎo)作用
6、,PPAs比OPAs對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用更有效。PCBLs、OPAs和PPAs都對(duì)caspase3/7,8,9有強(qiáng)烈的劑量依賴(lài)性的激活作用。細(xì)胞經(jīng)過(guò)20或40μg/mL濃度的PPAs處理后,對(duì)Caspase3/7,8,9的激活效果最強(qiáng)。通過(guò)Western Blot進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),PCBLs、OPAs和PPAs增加了促凋亡Bcl-2家族蛋白Puma、Bax和Bad的表達(dá),降低了抑凋亡蛋白Bcl-xL的表達(dá),表明其在內(nèi)凋亡途徑中發(fā)揮了作用。
7、PCBLs、OPAs和PPAs增加了DR5和Fas的表達(dá),證明其對(duì)外凋亡途徑也有影響。此外,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PCBLs對(duì)AKT和p53的表達(dá)沒(méi)有明顯的作用,但是OPAs和PPAs對(duì)AKT和p53的表達(dá)有顯著的影響。雖然不確定高聚體原花色素能否被吸收利用,但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PPAs(四聚體及更高聚合度的原花色素)整體上比OPAs(二聚體和三聚體)有更高的細(xì)胞毒性和更強(qiáng)的細(xì)胞凋亡活性。
(4)通過(guò)穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn),外界條件中,自然光、D65
8、和UV光源會(huì)一定程度上降低穩(wěn)定性;在30℃到80℃的范圍內(nèi),楊梅葉原花色素基本穩(wěn)定;在pH值為4.3-8.0范圍內(nèi),楊梅葉原花色素比較穩(wěn)定。此外,楊梅葉原花色素對(duì)Cu2+、Fe2+、Mg2+、Pb2+這四種常見(jiàn)金屬離子十分敏感。在常用化學(xué)基質(zhì)中,硼酸以影響pH的方式影響原花色素的穩(wěn)定性,保濕劑丙三醇比透明質(zhì)酸鈉對(duì)楊梅葉原花色素的穩(wěn)定性影響更小,防腐劑尼泊金甲酯對(duì)原花色素?zé)o顯著性影響,VC可以有效幫助提高楊梅葉原花色素的穩(wěn)定性。
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