VEGF轉(zhuǎn)基因絨山羊的檢測(cè).pdf

1、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial cell growth factor，VEGF），在人和動(dòng)物的毛囊中可以表達(dá)，是毛乳頭細(xì)胞的一種自分泌生長因子。研究表明，VEGF與動(dòng)物毛囊發(fā)育和毛發(fā)生長密切相關(guān)。在VEGF轉(zhuǎn)基因絨山羊的生產(chǎn)中，影響目的基因表達(dá)及其作用機(jī)理仍有待進(jìn)一步檢測(cè)和探索。
　　本實(shí)驗(yàn)室在2012年通過體細(xì)胞克隆技術(shù)得到了一批轉(zhuǎn)VEGF基因的轉(zhuǎn)基因絨山羊。本研究通過對(duì)產(chǎn)絨量顯著提高的一只轉(zhuǎn)基因絨山

2、羊（37號(hào)）和一只產(chǎn)絨量沒有明顯改變的轉(zhuǎn)基因絨山羊（41號(hào)）進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)與來自同一細(xì)胞系的體細(xì)胞克隆羊（5號(hào)）進(jìn)行對(duì)比，確定目的基因VEGF在轉(zhuǎn)基因絨山羊體內(nèi)的表達(dá)情況，進(jìn)而為深入探索目的基因的作用機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　本研究在DNA、RNA、蛋白以及宏觀水平對(duì)這三只轉(zhuǎn)基因絨山羊進(jìn)行檢測(cè)，得到如下主要結(jié)果:
　　1.對(duì)三只絨山羊進(jìn)行產(chǎn)絨量檢測(cè)，37號(hào)羊抓絨后體重為37.5 kg，產(chǎn)絨量為1095g;41號(hào)羊抓絨后體重為3

3、5 kg，產(chǎn)絨量為460g;5號(hào)體細(xì)胞克隆羊抓絨后體重為36.5kg，產(chǎn)絨量為450g。
　　2.通過PCR初步鑒定，37號(hào)羊和41號(hào)羊均為陽性，然后進(jìn)行southern bolt檢測(cè)，與PCR結(jié)果吻合。
　　3.本實(shí)驗(yàn)以Glucagon基因?yàn)閮?nèi)參，采用絕對(duì)定量PCR法檢測(cè)目的基因的拷貝數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Log2N(拷貝數(shù))=-0.3881△Ct+0.3093(R2=0.9983，p＜0.001)，計(jì)算得到37號(hào)和41號(hào)轉(zhuǎn)基因

4、絨山羊的拷貝數(shù)分別為0.82和0.97，結(jié)果顯示兩只轉(zhuǎn)基因羊的目的基因均為單拷貝。
　　4.以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，對(duì)兩只轉(zhuǎn)基因絨山羊進(jìn)行realtime PCR和westernblot檢測(cè)，其結(jié)果與體細(xì)胞克隆羊進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示，在37號(hào)羊中，VEGF在皮膚中的RNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)量分別為3.27和1.82倍，在血液中RNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)量分別為0.49和1.02倍;在41號(hào)羊中，VEGF在皮膚中的RNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)量分

5、別為0.93和1.16倍，在血液中RNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)量分別為0.24倍和0.86倍。
　　5.對(duì)37號(hào)、41號(hào)和5號(hào)羊皮膚做石蠟切片縱切，并進(jìn)行免疫熒光染色，在激光共聚焦顯微鏡下成像，并用顯微鏡自帶分析軟件對(duì)毛囊及其周圍組織的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果顯示，VEGF的熒光強(qiáng)度在37號(hào)羊的初級(jí)毛囊中是5號(hào)體細(xì)胞克隆羊的1.21倍，在41號(hào)羊中為1.07倍。
　　6.對(duì)37號(hào)、41號(hào)和5號(hào)羊皮膚做冰凍切片橫切，并進(jìn)行HE染色。結(jié)