徐淮山羊H-FABP基因克隆及轉基因小鼠和轉基因羊的制備.pdf

1、脂肪酸結合蛋白家族(FattyAcid-Bindingproteins，F(xiàn)ABPs)是一類小分子量蛋白，大小約為12-16KDa，該蛋白家族屬于載脂蛋白超家族(Lipocalinsuperfamily)，是一類脂肪酸轉運蛋白。該蛋白家族最早是1971年美國加州大學的Ocker等在研究大鼠的脂肪酸吸收的調節(jié)時，在小腸腸粘膜發(fā)現(xiàn)。到目前為止已經發(fā)現(xiàn)十一種亞型，根據(jù)其主要分布器官和組織不同，主要分為:腸型(Intestinal，I-FABP)

2、、心臟型(Heart，H-FABP)、肝臟型(Liver，L-FABP)、脂肪細胞型(Adipocyte，A-FABP)、腦型(BrainFABP)、表皮型(EpidermalFABP)、回腸型(IlealFABP)、髓磷脂型(MyelinFABP)、腎型(RenalFABP)、睪丸型(testisFABP，T-FABP)脂肪酸結合蛋白以及細胞視黃醇結合蛋白(CellRetinoidBindingProtein，CRBP)和細胞視黃醇酸

3、結合蛋白(CellRetinoidAcidBindingProtein，CRABP)。不同的亞型之間具有較強的同源性。該蛋白家族占細胞內可溶性蛋白總量的3％-8％。主要參與細胞內脂肪酸的運輸，可將脂肪酸從細胞膜上運送到甘油三酯和磷脂合成的位點，進而調節(jié)脂肪酸代謝。
　　 心臟型脂肪酸結合蛋白(heartfattyacidbindingprotein，H-FABP)在脂肪酸結合蛋白家族中分布最廣泛，作用也最為重要。它主要存在于3種

4、細胞之中:(1)β氧化速率高的細胞（如心肌、骨骼肌細胞）;(2)脂肪代謝強度高、尤其是類固醇合成旺盛的細胞（如內分泌系統(tǒng)的腎上腺皮質細胞、泌乳的乳腺）;(3)內胚層起源的細胞。在心肌中含量最為豐富，約占心臟全部可溶性蛋白的4％-8％。其主要作用是防止細胞內堆積游離脂肪酸。該蛋白是一種可溶性細胞質蛋白，分子量為14-15KDa。H-FABP是一種酸性蛋白質，在不同的物種之間具有較強的保守性。人H-FABP的一級結構由132個氨基酸殘基組成

5、，牛、羊、野豬、小家鼠等H-FABP的一級結構由133個氨基酸殘基組成。本研究克隆出徐淮山羊H-FABP基因CDS，并針對其進行一系列分析。結果顯示:徐淮山羊H-FABP基因CDS共有402bp，編碼133個氨基酸，蛋白分子量大小為14.76kDa，等電點為6.369，是一種酸性蛋白。徐淮山羊H-FABP基因序列和氨基酸序列與根據(jù)GenBank上報道的人、雞、褐家鼠、奶牛，野豬、驢及斑馬魚進行同源性比較，可知該基因在不同的物種之間具有較

6、高的保守性。該蛋白無信號肽，無糖基化位點，但是存在8個磷酸化位點。通過GFP示綜蛋白和間接免疫熒光雙重檢測，結果證實徐淮山羊H-FABP蛋白在細胞質中表達。
　　 通過睪丸注射法，將攜帶有徐淮山羊H-FABP的重組載體轉入雄性小鼠睪丸內，然后將雄鼠和空懷母鼠合籠，獲得G0代小鼠，經過DNA和蛋白水平檢測，最終獲得4％(7/175)的陽性個體。將G0代陽性個體自交獲得G1代小鼠，經過DNA和蛋白水平檢測，最終獲得30.23％(13

7、/43)的陽性的陽性個體。將G0和G1陽性個體采集心肌、腿肌和背最長肌，并測定其肌間脂肪含量，結果顯示陽性個體較陰性個體肌間脂肪含量顯著偏高。結果說明:外源基因的生物學功能在小鼠水平得到充分發(fā)揮。
　　 利用顯微注射法制備轉基因羊，將徐淮山羊H-FABP基因轉入波爾山羊成纖維細胞中，經過G418獲得陽性細胞系。將陽性細胞作為核供體注射入成熟去核卵母細胞中，再將重組胚胎植入受體母羊子宮中，并獲得4例陽性流產胎兒和一只活體陽性羔羊，