轉(zhuǎn)基因動物和動物克隆

1、轉(zhuǎn)基因動物和動物克隆,一、轉(zhuǎn)基因動物（概念、研究、問題）二、轉(zhuǎn)基因的“動物藥廠”三、抗感染動物四、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)路線中的轉(zhuǎn)基因胚胎干細胞五、基因敲除的小鼠模型（概念、方法、特點、應(yīng)用）六、克隆羊和動物克隆（概念、意義）七、克隆人,,,,世界首只轉(zhuǎn)基因靈長類動物 ——-安迪,世界第一只轉(zhuǎn)基因動物,,一、什么是轉(zhuǎn)基因動物,轉(zhuǎn)基因動物是指用實驗導入的方法將外源基因在染色體基因內(nèi)穩(wěn)定整合并能穩(wěn)定表達的一類

2、動物。（包括基因敲除的動物）,動物基因工程的發(fā)展狀況與趨勢,動物基因工程的實質(zhì)是改變動物的遺傳組成，增加動物的遺傳多樣性，賦予轉(zhuǎn)基因動物新的表型特征，使能夠更好地服務(wù)與人類社會。,1、從簡單的顯微注射法向高效率的轉(zhuǎn)基因體細胞核移植方向發(fā)展 從轉(zhuǎn)基因的技術(shù)手段來看，除DNA顯微注射法外，人們先后試過反轉(zhuǎn)錄病毒載體介導法、精子介導法、胚胎干細胞介導法和核移植法等多種轉(zhuǎn)基因方法。 轉(zhuǎn)基因細胞的核移植技術(shù)

3、已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的主流方法。,2、從外源基因隨機插入（或整合）到定點整合的轉(zhuǎn)變轉(zhuǎn)基因在基因組中的存在方式有兩種，即隨機整合和定點整合。,為了達到外源基因的高效表達，在轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)上增加了含有位點控制區(qū)（LCR）、核基質(zhì)附著區(qū)(MAR)等調(diào)控元件，可以實現(xiàn)插入位點非依賴性、拷貝數(shù)相關(guān)的表達模式。LCR和MAR的功能不受種屬差異的限制，無論外源基因插入什么位點，都能夠維持一個開放的染色體結(jié)構(gòu)，有利于基因的表達。 基因打靶

4、技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展，實現(xiàn)了對目的基因的定位操作。,從轉(zhuǎn)基因的策略來看，動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了兩個階段：第一階段為傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因動物階段，第二階段為條件性轉(zhuǎn)基因動物階段。　　　借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)可將單一的功能基因和基因簇引入高等動物的基因組，或?qū)⒛康幕驈膭游锘蚪M中敲除，實現(xiàn)了種系內(nèi)和種系間基因轉(zhuǎn)移或修飾，產(chǎn)生新的基因型和表型。　　 目前轉(zhuǎn)基因動物主要應(yīng)用在生物學基礎(chǔ)研究、醫(yī)學疾病模型、動物生物反應(yīng)器、異種器官移植、動物遺傳改良等５

5、個方面。,３、從傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因到條件控制的轉(zhuǎn)變,轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)路線,經(jīng)典的技術(shù)路線  目的基因 顯微注射 已交配的 取出 移植 受體動物 妊娠供體動物 受精卵 輸卵管 轉(zhuǎn)基因動物 缺

6、點：注入目的基因的命中率低，目的基因的整合率低，受精卵移植的受孕率低。,,,,,整合胚胎移植的技術(shù)路線 轉(zhuǎn)基因動物 受體動物子宮 目的基因 非手術(shù)

7、 胚胎移植  體外受精 體外培養(yǎng) 多細胞胚胎 檢測 整合外源基因卵子 受精卵 或囊胚 的胚胎精子優(yōu)點：受精卵的成活率高達90％以上，外源基因整合率高，提高受孕率。,,,,,,,核移植（克?。┑募?/p>

8、術(shù)路線 目的基因 轉(zhuǎn)基因動物  導入 . 動物胎兒成纖維細胞 妊娠

9、 取核 動物 去核 重組的 體外培養(yǎng) 囊胚期 胚胎移植 卵細胞 受精卵 胚胎 受體動物子宮,,,,,,,轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的主要步驟,獲取外源目的基因外源目的基因與專性基因表達啟動子、增強子、報告基因等構(gòu)件的拼接重組。外源重組目的基因?qū)肷臣毎蚺咛ジ杉毎x擇攜帶目的基因的細胞，選擇體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動物

10、轉(zhuǎn)基因胚胎的發(fā)育及鑒定篩選所得的轉(zhuǎn)基因動物,一、轉(zhuǎn)移基因(一)轉(zhuǎn)移基因的原理：轉(zhuǎn)基因技術(shù)的理論基礎(chǔ)在于各種生物的遺傳密碼都是統(tǒng)一的。都是以3個堿基決定一個氨基酸這樣的密碼形式貯存在DNA鏈上，各物種間形狀的不同僅僅是由于DNA上的四種核苷酸排列次序的不同，同時各種生物從DNA到蛋白質(zhì)合成都服從“中心法則”, 當一個物種的細胞內(nèi)加入另一物種或人工合成的DNA(即基因)后就可能產(chǎn)生新的性狀。,(二)基因的獲得：取自現(xiàn)有的生物體如病毒、

11、細菌、體細胞或腫瘤細胞的DNA,用限制內(nèi)切酶或外切酶把DNA切割成若干小段,然后再把這些小段利用連接酶分別放入載體中,并建成克隆載體。 基因的片斷可隨載體復制，有時亦可表達，用DNA 或抗體探針做分子雜交試驗或ELISA試驗篩選出帶有理想基因的克隆,再把理想基因載體放入大腸桿菌等宿主細胞中擴大、增殖,或采用PCR的方法擴增。再對擴增的DNA片斷進行適當修飾,例如將一個單一的基因與經(jīng)選擇的啟動子重組合，然后進行轉(zhuǎn)

12、移，或?qū)⑻囟ǖ目刂菩蛄羞B接到目的基因的結(jié)構(gòu)序列上，從而創(chuàng)造1個新的重組基因,然后再進行轉(zhuǎn)移。,理想基因也可用人工合成的辦法獲得，要合成一特定的基因，就是要合成具有一定排列順序的DNA，DNA上四種堿基的配對是非常嚴格的,腺嘌呤(A)必定和胸腺嘧啶(T) 配對，鳥嘌呤(G)必定和胞嘧啶(C)配對，由于蛋白質(zhì)合成不是直接以DNA作為模板,而是以DNA的副本mRNA作為模板，在RNA中，用尿嘧啶(U)代替了胸腺嘧啶(T)。,二、基因轉(zhuǎn)移的受體

13、細胞,(一)原生殖細胞：禽類的原生殖細胞容易分離、培養(yǎng)和冷凍，所以，這種受體細胞在禽類動物較易實現(xiàn)。(二)配子：配子能把自身攜帶的基因組全部信息和外源插入基因序列，完整地貢獻給合子。由于精子可用作有效的轉(zhuǎn)移載體，所以，可以精子作為目的基因的受體。較多的是用重組病毒直接感染精子，精子即可把外源基因傳到合子。,(三)受精卵或胚胎內(nèi)細胞團：精卵結(jié)合形成的單細胞受精卵，是最常用的外源基因轉(zhuǎn)移的受體；受精后的早期胚胎及囊胚期稍后的胚胎含有的內(nèi)細

14、胞團，該細胞團內(nèi)含有未分化的胚胎干細胞，也可認為是全能的，或至少是多能性的，所以，用該時期的內(nèi)細胞團或囊胚期的細胞作為外源基因的受體細胞，也可望達到基因轉(zhuǎn)移的目的。但這種情況下制備的轉(zhuǎn)基因動物多為嵌合體。,三、實驗動物的準備主要敘述制備轉(zhuǎn)基因鼠的實驗程序。(一)不育雄性公鼠:結(jié)扎公鼠與母鼠交配以后產(chǎn)生假孕母鼠。受結(jié)扎的公鼠需8周以上，對種系無特殊要求。在正式實驗前，結(jié)扎公鼠需與性成熟的雌性小鼠交配，反復交配兩次或三次，經(jīng)檢查雌體有

15、陰道栓，但均不懷孕產(chǎn)仔，則證明結(jié)扎成功。結(jié)扎公鼠使母鼠產(chǎn)生陰道栓的能力可維持2年。值得注意的是，如結(jié)扎公鼠與母鼠交配4～6 次均不能產(chǎn)生陰道栓，則該公鼠必須更換。,(二)假孕雌性母鼠:作為獲得外源基因即轉(zhuǎn)基因胚胎的養(yǎng)母，要求6周齡至5 個月較合適，對種系無特殊要求。其生殖系統(tǒng)的生理狀態(tài)應(yīng)與移進胚胎的發(fā)育階段同步化，從而為移植胚胎提供著床和繼續(xù)發(fā)育的生理條件。將選好的成年健康雌性個體與不育雄性個體進行交配，時間應(yīng)與供體(取受精卵的雌體)同

16、時進行。一般為下午4點鐘合籠,次日晨選有陰道栓的待用。,(三)取受精卵的雌性母鼠：如果無特殊遺傳背景的要求，一般用雜交F1受精卵較為理想。因雜交F1代胚胎的發(fā)育能力和對外環(huán)境的耐受能力都較強，有益于提高移植胚胎的出生率。,在對遺傳背景有特殊要求的情況下，供卵母鼠需選擇種系，例如把一種鼠的等位基因轉(zhuǎn)移到另一種不同等位基因的種系，這種卵供體母鼠必須有特定的遺傳背景，因此需用純系鼠。在實際操作中，一般用4～6周母鼠作為超排卵供體，3～4周母

17、鼠產(chǎn)卵更多但卵細胞膜脆性較大，在處理過程中易破裂，而6周以后母鼠產(chǎn)卵逐漸減少。,四、基因?qū)氲姆椒?一)顯微注射法：在顯微鏡下，可借助顯微操作儀，將毛細玻璃管直接插入受精卵的雄原核中(較大的原核),注入特定的外源基因,即為基因顯微注射法。下面把利用顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因鼠的方法和步驟簡述如下。,1. 超數(shù)排卵(超排)與取卵 (1)超數(shù)排卵：在雌性動物發(fā)情周期的某一階段,用促性腺激素促使卵巢里大量卵泡成熟并排出，稱超數(shù)排卵。影響母鼠超排

18、因素有母鼠的性成熟程度、營養(yǎng)、體重及母鼠種系。超排的最佳時間隨種系不同而異,一般在3～5周，超過6周超排卵數(shù)明顯減少。,在實際操作中常取4～6周齡的母鼠作超排卵供體，腹腔注射孕馬血清(PMS) 和人絨毛膜促性腺激素(hCG)誘導母鼠排卵。PMS模擬卵泡刺激素(FSH)作用，hCG模擬黃體生成素(LH)的作用。二者注射時間間隔為42～48h，排卵發(fā)生在注射hCG后10～13h,注射劑量為每鼠5～10u。為了實驗方便，常在下午注射PMS，隔

19、日同一時間注射hCG，注射hCG 后每只母鼠置于一個單獨飼養(yǎng)的正常公鼠籠內(nèi)，次日晨檢查陰道栓。,(2)取卵：用頸椎脫臼法處死有陰道栓的雌鼠，把完整的輸卵管帶一小段子宮剪下,置于PBS平衡鹽溶液中，在解剖鏡下找出輸卵管傘部，用帶4號針頭的注射器將受精卵沖出，立即將卵子換至新鮮培養(yǎng)液內(nèi)洗滌3～4次即可用于顯微注射。,2. 注射外源DNA：顯微注射需用顯微操作儀，用來控制顯微持卵針和顯微注射針。持卵針是顯微注射時固定受精卵的細玻璃管，管口平滑

20、，通過一注射器控制持卵針，使其吸住要進行注射的受精卵。用來注射外源DNA的細注射針管表面平滑，尖端鋒利,便于注射時穿過透明帶、細胞膜等。,取已制備好的受精卵細胞和外源DNA懸液,在倒置顯微鏡下做顯微注射。注射時先用持卵針吸住受精卵，再用注射針吸取外源DNA懸液,然后推動注射針，使其刺入受精卵的雄原核，將DNA注入。注射完畢，慢慢抽出注射針,將受精卵放入新的培養(yǎng)液中，使其恢復。一般50～80％的受精卵在顯微注射后仍保持健康。（P120）,

21、3. 注射后受精卵(或胚胎)的移植：注射后單細胞至桑椹胚的卵(受精后0.5天到3.5天)移植至受孕后的0.5天的假孕鼠的輸卵管，輸卵管移植需用被透明帶包裹的卵。也可將注射有外源DNA的受精卵或桑椹胚體外培養(yǎng)至囊胚，再行移植。顯微注射后3.5天的囊胚移植至受孕后2.5天的假孕鼠子宮，子宮移植不需要有透明帶。,此法的優(yōu)點是，在一定設(shè)備和經(jīng)驗條件下，實驗過程大為簡化；任何DNA 順序都可直接導入原核內(nèi),導入的外源DNA在卵裂前與受體基因組整合

22、,其缺點在于導入的外源DNA通常以多拷貝串聯(lián)的形式隨機地整合于受體基因組中，妨礙其表達的正常調(diào)節(jié)。,(二)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法：以逆轉(zhuǎn)錄病毒作載體， 把重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體DNA包裝成高滴度病毒顆粒，感染發(fā)育早期的胚胎，將外源基因?qū)胨拗鞯娜旧w內(nèi)的方法稱為逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法。此法操作簡單，可通過注射將重組病毒轉(zhuǎn)移到囊胚腔內(nèi)，也可將去透明帶的胚胎與分泌重組病毒顆粒的細胞共培養(yǎng)，以達到將外源DNA 轉(zhuǎn)移到胚胎中去的目的。,這一方法的優(yōu)點是，重組

23、逆轉(zhuǎn)錄病毒可同時感染大量胚胎。感染后的整合率高；外源DNA在受體細胞基因組中的整合通常是單拷貝的；不需要昂貴的顯微注射設(shè)備。本法的缺點是，由于選用的受體是早期胚胎，不是受精卵，致使外源DNA 在動物各種組織中的分布不均,不易整合到生殖細胞中；由于病毒衣殼大小有限,限制了被導入的外源 DNA的大小，一般不超過15Kb。,(三)胚胎干細胞介導法：干細胞(Stem Cell)是一種未充分分化，尚不成熟的細胞，具有再生各種組織器官和人體

24、的潛在功能，醫(yī)學界稱之為“萬用細胞”。 干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞。它包括胚胎干細胞和成體干細胞。干細胞的發(fā)育受多種內(nèi)在機制和微環(huán)境因素的影響。,胚胎干細胞（embryonic stem cell,ES）：是胚胎發(fā)育期的胚細胞，可以人工培養(yǎng)增殖并具有分化成其它類型細胞的功能。,ES細胞的全能性指ES細胞在解除分化抑制的條件下能參與包括生殖腺在內(nèi)的各種組織的發(fā)育潛力，即ES細胞具有發(fā)育成完整動物體的能力，可以為細胞的遺傳操

25、作和細胞分化研究提供豐富的試驗材料。,ES細胞的形態(tài)學特征 ES細胞具有與早期胚胎細胞相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，細胞核大，有一個或幾個核仁，胞核中多為常染色質(zhì)，胞質(zhì)胞漿少，結(jié)構(gòu)簡單。體外培養(yǎng)時，細胞排列緊密，呈集落狀生長。用堿性磷酸酶染色，ES細胞呈棕紅色，而周圍的成纖維細胞呈淡黃色。,,,,,細胞克隆和周圍存在明顯界限，形成的克隆細胞彼此界限不清，細胞表面有折光較強的脂狀小滴。細胞克隆形態(tài)多樣，多數(shù)呈島狀或巢狀。小鼠ES細胞的直徑7 μm～

26、18 μm，豬、牛、羊ES細胞的顏色較深，直徑12 μm～18 μm。,,,采用這一方法的優(yōu)點是，外源DNA的整合率高； 整合在生殖細胞中的比例也很高。缺點是，ES細胞株不易建立，長期培養(yǎng)后出現(xiàn)細胞分化現(xiàn)象；生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動物都是嵌合體。,(四)精子載體法 將外源DNA與精子一起孵育，精子可捕獲外源DNA，并通過受精過程將外源DNA導入受精卵。此法不僅可免去復雜而昂貴的設(shè)備， 且可省去不少繁雜的操作和條件準備。但該法有些結(jié)果不能重復。此

27、外，還有一些其它的方法，都有不同的優(yōu)缺點。,(五)基因敲除的小鼠模型的建立方法,基因敲除是向正常生物個體內(nèi)引入某個突變基因位點而選擇性地使某特定基因功能失活的技術(shù).可培養(yǎng)出靶向性剔除某基因的小鼠，而導致行為特性改變。,培育基因靶向性敲除小鼠的實施步驟為：1.首先將某基因突變位點經(jīng)同源重組引入小鼠ES細胞。2.將含有靶向敲除的突變基因位點的ES細胞注入小鼠早期胚胎中, 孕育出嵌合小鼠, 此嵌合小鼠體內(nèi)胚系細胞群和體細胞群都會有來自E

28、S細胞和受者胚胎鼠細胞的DNA。,3.檢測嵌合小鼠交配后的生殖細胞內(nèi)是否整合有突變的基因位點。4.在各只敲除的突變基因位點雜合性小鼠之間交配, 以產(chǎn)生純合性基因敲除小鼠。,特點,培養(yǎng)成功率低，技術(shù)難度大，盡管對研究遺傳與疾病的相關(guān)性十分有用，但若敲除致命的功能基因，可使胚胎早期發(fā)生死亡。若所敲除基因可被其他功能基因代償，則使表型改變模糊不明，有局限性。,（六）細胞核移植法,,核移植也稱克隆或無性繁殖，是將分離的胚胎卵裂球(核供體)或體

29、細胞核與成熟并去核的卵母細胞或去核的原核期受精卵的去核胚胎(核受體)融合，不經(jīng)過有性繁殖過程，連續(xù)不斷地復制遺傳上相同的胚胎，并通過克隆胚胎的移植生產(chǎn)大量同基因型的克隆動物系或動物群的一項動物繁殖新技術(shù)。,小結(jié),五、轉(zhuǎn)基因鼠的檢測待假孕母鼠產(chǎn)出幼仔后,可用幼鼠尾巴提取DNA;對于一些基因調(diào)控研究,需要盡快獲得信息而暫不需保留轉(zhuǎn)基因鼠，從胎鼠組織或幼鼠尾巴提取的DNA,可用PCR、Dot blot(斑點雜交)、Southern blo

30、t(Southern轉(zhuǎn)移)等多種方法分析以確定是否轉(zhuǎn)基因鼠。,六、基因轉(zhuǎn)移后的存在方式及表達(一)外源基因?qū)牒蟮拇嬖诜绞剑和庠椿虮粚胧荏w細胞后，在受體細胞內(nèi)的存在方式有三種：1. 非同源重組。大多數(shù)外源基因?qū)胧荏w細胞后,與受體細胞染色體的某一位點隨機整合，這樣可帶來正?；虻牟迦搿⑷笔?、易位等突變。2. 同源重組。導入的外源DNA與受體細胞染色體的DNA 通過順序取代或順序插入實現(xiàn)同源重組。通過同源重組有可能導致受體細胞正

31、常的基因發(fā)生突變，當然，也有可能代替原來的有遺傳缺陷的遺傳基因，從而糾正遺傳缺陷。,3. 游離存在。外源基因沒有整合到受體細胞中,而是以附加體的形式游離在受體細胞內(nèi)，能自我復制，并能100％的傳給下一代。,(二)外源基因?qū)牒蟮谋磉_：外源基因?qū)胧荏w細胞后能否表達，是受許多因素影響的。1. 外源基因本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。2. 附帶的原核載體順序。研究發(fā)現(xiàn)，原核載體的存在對α-甲胎蛋白、β- 珠蛋白等基因的表達具有明顯的抑制作用，而對免疫

32、球蛋白和膠原蛋白基因的抑制不明顯。,3. 染色體位置。 外源基因在受體動物細胞染色體上整合部位的基因環(huán)境對外源基因表達的影響很大。4. 甲基化。被轉(zhuǎn)移的基因容易甲基化而失活。外源基因在受體細胞中的表達方式表現(xiàn)為組織特異性和發(fā)育階段特異性。組織特異性表達是由于某些調(diào)節(jié)元件如啟動子和增強子的作用造成的。,轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用研究,改良動物經(jīng)濟性狀的嘗試試圖通過轉(zhuǎn)移單個基因改良動物經(jīng)濟性狀的研究，至今仍未見成功的報道，尚需對性狀表現(xiàn)的生化代

33、謝途徑，有關(guān)基因的相互作用以及基因定位整合，基因定量表達、組織特異性表達等進行深入的研究。,乳腺生物反應(yīng)器的研究1987年，Gordon首次報道小鼠乳腺中表達tPA蛋白。至今國際上轉(zhuǎn)基因羊、轉(zhuǎn)基因牛等的成功報道實例已有10多種，生產(chǎn)出抗胰蛋白酶、乳鐵蛋白、人凝血蛋白因子Ⅷ、蛋白質(zhì)C等藥用蛋白。國外經(jīng)濟學家預期，10年后，轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的藥物銷售額超過250億美元。,基因藥物生產(chǎn),基因藥物生產(chǎn)第一階段是細菌基因工程，第二階段是動物細胞基

34、因工程，第三階段是轉(zhuǎn)基因動物—乳腺生物反應(yīng)器。具有以下特點：⑴乳腺是自我封閉系統(tǒng)，乳腺表達的蛋白質(zhì)不回流到血液循環(huán)系統(tǒng)，避免外源基因表達的蛋白質(zhì)對動物本身的影響；,⑵乳腺組織是一種有效的蛋白質(zhì)合成器。一頭奶牛一年可生產(chǎn)乳蛋白250—300Kg，一只綿羊或山羊一年可生產(chǎn)乳蛋白25—30Kg。如果有百分之一的乳蛋白代換成醫(yī)用蛋白，產(chǎn)量十分可觀。,⑶乳腺分泌的基因產(chǎn)物不但產(chǎn)量高，而且易提純。表達的蛋白經(jīng)過充分的修飾加工，具有穩(wěn)定的生物活性。

35、生物活性接近天然產(chǎn)品。⑷在動物乳腺表達的外源基因可以遺傳，可用常規(guī)技術(shù)繁殖生產(chǎn)群體。,轉(zhuǎn)基因動物研究存在的問題,轉(zhuǎn)基因動物的低效性 轉(zhuǎn)入基因引起完整基因突變 轉(zhuǎn)入基因表達混亂 病毒轉(zhuǎn)基因?qū)λ拗鞯挠绊?轉(zhuǎn)基因動物模型與預期不符 乳腺反應(yīng)器的完善 轉(zhuǎn)基因動物及產(chǎn)品的認可,動物克隆的重大意義,動物克隆技術(shù)不僅理論上有重大突破，無需有性繁殖即可生產(chǎn)動物，而且可利用克隆羊技術(shù)來克隆人體器官，有醫(yī)學價值，還可使難以生殖或即將滅種的動物