alpha-dystrobrevin基因在心肌致密化不全中的分子遺傳學(xué)探討及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型構(gòu)建.pdf

1、背景：心肌致密化不全（Noncompaction of the Ventricular Myocardium，NVM）是一種遺傳性心肌病，與Tafazzin（TAZ），LIM域結(jié)合蛋白3（LIM domain binding3，LDB3），α-dystrobrevin（DTNA），他克莫司結(jié)合蛋白1A（FK506 binding protein1A，F(xiàn)KBP1A），核纖層蛋白1B（Lamin1B，LMNB1）及肌節(jié)蛋白基因（Sarcom

2、ere protein genes）等基因異常相關(guān)。DTNA位于常染色體18q12，其編碼的蛋白位于心肌和骨骼肌的肌膜上參與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，即可為心肌等細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支持，還參與細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。Notch基因?qū)π呐K發(fā)育起重要作用。在心肌小梁發(fā)育早期發(fā)現(xiàn)存在Notch信號(hào)活動(dòng)。DTNA是否通過與發(fā)育相關(guān)的Notch信號(hào)通路對(duì)早期胚胎骨架形成產(chǎn)生影響？其異常是否會(huì)導(dǎo)致NVM這類遺傳性心肌病的發(fā)生。目前這些機(jī)制仍然不明。
　　目的：篩

3、查NVM患者DNA標(biāo)本，尋找相關(guān)致病基因及變異。構(gòu)建攜帶突變基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，以發(fā)現(xiàn)突變基因的致病機(jī)制及相關(guān)信號(hào)通路，為將來尋求基因治療新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　方法：對(duì)所收集的18例NVM患者DNA標(biāo)本，以DNA直接測序法篩查候選基因TAZ，LDB3，DTNA，F(xiàn)KBP1和LMN的全部外顯子、外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)，并與100個(gè)正常人基因序列比對(duì)，尋找基因突變；用DnpI點(diǎn)突變策略將正常基因的cDNA定點(diǎn)突變，通過顯微注射方法

4、將突變基因注入小鼠受精卵中，構(gòu)建成攜帶突變基因的轉(zhuǎn)基因小鼠；對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行Western Blot蛋白印跡觀察、組織細(xì)胞學(xué)鑒定及心臟超聲及游泳運(yùn)動(dòng)負(fù)荷實(shí)驗(yàn)等功能檢測。同時(shí)，尋找與DTNA基因相關(guān)的信號(hào)通路。
　　結(jié)果：發(fā)現(xiàn)一例患者存在DTNA第4外顯子上的第146位堿基A→G的錯(cuò)義突變（Asn49Ser，N49S）。經(jīng)過構(gòu)建α-MyHC-pSK-RSV-m87k（16.1）-DTNA Asn49Ser表達(dá)載體，獲得可以將DTNA

5、 Asn49Ser突變基因遺傳給子代并在心肌表達(dá)的mDB2/+轉(zhuǎn)基因小鼠品系。mDB2/+小鼠心尖部的左心室壁疏松層可見多小梁結(jié)構(gòu)，致密層（外層）肌纖維排列稀松，心室壁游離面的疏松層與致密層比值比陰性小鼠及野生型小鼠高。4月齡的mDB2/+小鼠左室后壁厚度明顯大于mDB2/-小鼠及野生型小鼠，提示陽性鼠有心室肌壁增厚的改變，但與心室收縮及舒張功能相關(guān)的其他指標(biāo)無明顯變化。8月齡小鼠中的左心室室壁厚度比其他兩組明顯減小，提示左室壁變薄；雖

6、然舒張末期的左室直徑及容積和每搏輸出量與其他組相比差異不大，但由于收縮末期左室直徑及容積明顯增大，左室射血分?jǐn)?shù)及心肌縮短率明顯降低，提示8月齡mDB2/+小鼠心肌收縮功能減退。小鼠游泳運(yùn)動(dòng)負(fù)荷實(shí)驗(yàn)顯示，4月齡及8月齡小鼠，mDB2/+組，與mDB2/-組及野生型相比，運(yùn)動(dòng)耐受時(shí)間有減少趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；12月齡小鼠，mDB2/+組，與與 mDB2/-組及野生型相比，運(yùn)動(dòng)耐受時(shí)間明顯減少，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），mDB2/-

7、組與Wildtype組間運(yùn)動(dòng)耐受時(shí)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。mDB2/+小鼠心肌中Notch1的表達(dá)量明顯高于同代同齡陰性及野生型小鼠。
　　結(jié)論：DTNA Asn49Ser突變基因是NVM的致病基因；mDB2/+小鼠心尖部的左心室壁疏松層可見多小梁結(jié)構(gòu)，致密層（外層）肌纖維排列稀松，心室壁游離面的疏松層與致密層比值比陰性小鼠及野生型小鼠高，有心肌致密化不全的疾病發(fā)展趨勢。Notch1依賴的信號(hào)通路可能參與了與致病基因DTNA相關(guān)的心肌致密