山羊BLG-CMV調(diào)控序列指導(dǎo)hLF基因在細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá).pdf

1、利用動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器來生產(chǎn)藥用蛋白，是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的主要應(yīng)用之一。轉(zhuǎn)基因家畜乳腺生物反應(yīng)器的研制周期較長，成本較高，因此在制作轉(zhuǎn)基因家畜之前，對(duì)乳腺表達(dá)載體表達(dá)性能的驗(yàn)證是比較重要的。本試驗(yàn)在乳腺上皮細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因小鼠中對(duì)我們實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的人乳鐵蛋白基因乳腺表達(dá)載體(BLCl4)進(jìn)行驗(yàn)證，為制備轉(zhuǎn)基因山羊乳腺生物反應(yīng)器奠定基礎(chǔ)。 1.BLCl4載體的組成：將山羊β-乳球蛋白基因調(diào)控序列，包括4.2kb的5'端和1.8 kb的3'端，

2、人乳鐵蛋白(hLF)cDNA，人巨細(xì)胞病毒(CMV)增強(qiáng)子序列及SV40 polyA序列和新霉素抗性篩選基因(Neor)等基因元件體外重組構(gòu)建成人乳鐵蛋白基因乳腺表達(dá)載體BLCl4。 2.乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)：采用膠原酶和透明質(zhì)酸酶共同消化法從健康的泌乳期山羊乳腺組織中分離到原代乳腺細(xì)胞；采用胰蛋白酶消化和反復(fù)貼壁法在DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)2-3代，獲得純化的乳腺上皮細(xì)胞。通過電轉(zhuǎn)染法將表達(dá)載體BLCl4導(dǎo)入純化乳腺上皮細(xì)胞

3、中，經(jīng)G418篩選14d左右，獲得59株抗G418的單克隆細(xì)胞株，對(duì)擴(kuò)大培養(yǎng)的抗性細(xì)胞株進(jìn)行催乳素誘導(dǎo)，收集誘導(dǎo)后48h的細(xì)胞上清液進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示8株G418抗性細(xì)胞株能夠表達(dá)重組人乳鐵蛋白，克隆表達(dá)率為13.6％。 3.轉(zhuǎn)基因小鼠制備：將BLCl4構(gòu)件的質(zhì)粒用Sall與Notl限制性內(nèi)切酶消化，回收純化約10.6kb的基因片段。注射PMSG和hCGr使6—8周齡的C57♀超數(shù)排卵，與ICR♂進(jìn)行交配后，獲得受精卵

4、1486枚，通過原核顯微注射法將表達(dá)載體片段注射到小鼠受精卵雄原核中，注射后存活卵數(shù)(移植數(shù))683枚，移植受體數(shù)26只，受體懷孕數(shù)10只，獲得仔鼠46只，經(jīng)過PCR檢測(cè)，有4只(1♀，3♂)為轉(zhuǎn)基因小鼠，整合率為8.69％。將轉(zhuǎn)基因小鼠分別與正常小鼠交配，得到的后代經(jīng)PCR檢測(cè)，25號(hào)(♂)轉(zhuǎn)基因小鼠的后代(F1代)中有6只為轉(zhuǎn)基因小鼠，整合率為37.5％(6/16)；而11號(hào)(♂)轉(zhuǎn)基因小鼠的后代(F1代)中未有基因整合小鼠。

5、 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和蛋白印跡法(Westem blot)對(duì)BLCl4原代轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中表達(dá)的重組人乳鐵蛋白進(jìn)行檢測(cè)。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明在BLCl4原代轉(zhuǎn)基因小鼠(19號(hào))的乳汁中人乳鐵蛋白表達(dá)呈陽性，表達(dá)量約為1.5mg/mL。Westem blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中rhLF表達(dá)產(chǎn)物中有一個(gè)條帶與標(biāo)準(zhǔn)人乳鐵蛋白分子量相同，并且在20kDa大小的地方還有另外一個(gè)條帶。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建的BLCl4載體能