山羊BLG調(diào)控序列及CMV增強(qiáng)子指導(dǎo)人胰島素原基因在細(xì)胞和小鼠中表達(dá).pdf

1、糖尿病是一種以胰島素缺乏及高血糖為主要特征的自身免疫性疾病。目前治療除注射外源性胰島素外，尚無其他切實有效的方法。近年來，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)人胰島素的方法是目前研究的熱點。 本實驗室已經(jīng)用人胰島素原基因組DNA與山羊乳蛋白調(diào)控序列、增強(qiáng)子序列以及新霉素抗性基因構(gòu)建了人胰島素原基因乳腺特異性表達(dá)載體BIC13。本課題利用該表達(dá)載體在細(xì)胞和動物水平上的表達(dá)特性，來驗證其在乳腺生物反應(yīng)器上生產(chǎn)的可行性。

2、本試驗采用電穿孔方法將人胰島素原基因乳腺特異性表達(dá)載體片段導(dǎo)入奶山羊乳腺上皮細(xì)胞，經(jīng)含400μg/ml G418的篩選培養(yǎng)液篩選培養(yǎng)兩周，得到有抗性的細(xì)胞株。挑取單克隆株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后。提取其細(xì)胞基因組，經(jīng)PCR檢測后，對陽．性細(xì)胞株用催乳素誘導(dǎo)表達(dá)，48小時后提取細(xì)胞誘導(dǎo)液，用ELISA法檢測誘導(dǎo)液中的胰島素原。結(jié)果獲得6株表達(dá)的陽性細(xì)胞株。 本試驗采用顯微注射的方法將人胰島素原乳腺特異性表達(dá)載體片段注射入小鼠受精卵的雄原核，

3、對出生的小鼠經(jīng)PCR整合檢測后，對篩選到的陽性小鼠用ELISA法檢測其乳汁及血液中胰島素原。本次試驗共注射632枚受精卵，存活471枚卵。產(chǎn)仔43只。通過PCR整合檢測，獲得一只轉(zhuǎn)基因陽性小鼠(編號＃6)，對其乳汁和血液的ELISA檢測表明該構(gòu)件可在小鼠乳腺中表達(dá)并具有乳腺特異性。 因此，本實驗室構(gòu)建的人胰島素原基因乳腺特異性表達(dá)載體不僅能有效的指導(dǎo)人胰島素原在山羊乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺中的表達(dá)，而且具有乳腺組織特異性?？梢杂糜?/p>