短序列增強(qiáng)子和Alu重復(fù)序列影響基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究和生物信息學(xué)分析.pdf

1、目的:
　　在本研究中，我們重點(diǎn)研究的是AA序列及其突變序列調(diào)節(jié)GFP報(bào)告基因表達(dá)的作用機(jī)制及增強(qiáng)子序列的結(jié)構(gòu)對基因表達(dá)所產(chǎn)生的影響。并做了一些關(guān)于Alu元件的實(shí)驗(yàn)研究和生物信息學(xué)分析。
　　方法:
　　1.DNA模板及引物的合成。
　　2.表達(dá)載體的構(gòu)建。
　　2.1 AA及其衍生序列相關(guān)表達(dá)載體的構(gòu)建。
　　2.2 Alu相關(guān)表達(dá)載體的構(gòu)建。
　　3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　4.熒光顯微鏡觀察<

2、br>　　5.RT-PCR
　　6.聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)
　　7.流式細(xì)胞儀檢測
　　8.生物信息學(xué)分析
　　結(jié)果:
　　1.質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
　　通過酶切和基因測序兩種檢測手段鑒定本文實(shí)驗(yàn)中所用的質(zhì)粒表達(dá)載體均正確。
　　2.AA及其衍生序列對GFP基因表達(dá)的影響
　　質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa胞后，在熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，通過比較熒光陽性細(xì)胞率，我們發(fā)現(xiàn)22R，4TMI，AA可

3、以活化GFP報(bào)告基因，而4T，TT，7PieA和7PieT不能活化GFP報(bào)告基因，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AA序列中的T堿基逐一突變?yōu)锳，G，C而衍生的15個(gè)序列均具有增強(qiáng)子活性，其中大部分突變序列的增強(qiáng)子活性略低于AA序列，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.AA序列在轉(zhuǎn)錄水平增強(qiáng)GFP報(bào)告基因表達(dá)
　　AA序列活化GFP報(bào)告基因能力強(qiáng)于7pieA序列，為了研究AA序列活化GFP報(bào)告基因的機(jī)制，我們利用RT-PCR方法檢測GFPRN

4、A表達(dá)水平。為增加實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，我們采用三對引物擴(kuò)增不同位置的GFP RNA。研究發(fā)現(xiàn)AA序列比7pieA和Alu14序列能夠誘導(dǎo)更多的GFPRNA。這些結(jié)果與GFP蛋白檢測結(jié)果一致，從而說明質(zhì)粒中插入AA序列可以增加細(xì)胞內(nèi)GFP RNA含量。由于基因的轉(zhuǎn)錄增加或者RNA降解減慢都可能造成細(xì)胞內(nèi)RNA含量增加，即GFP RNA含量增加可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，也可能發(fā)生在RNA降解水平。為了研究這個(gè)問題，我們利用放線菌素D抑制RNA生成，再采

5、用RT-PCR檢測GFP RNA含量。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，假設(shè)細(xì)胞中的RNA降解速率相同，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒中插入AA序列的GFPRNA含量要高于質(zhì)粒中插入7pieA序列的GFP RNA含量，這些結(jié)果表明，AA序列誘導(dǎo)更多GFP報(bào)告基因蛋白表達(dá)是GFP報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄增加的結(jié)果，即AA序列增強(qiáng)GFP報(bào)告基因表達(dá)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。
　　4.利用PAGE觀察DNA寡核苷酸構(gòu)象
　　在室溫條件的PAGE中，利用20％變性膠PAGE我們發(fā)現(xiàn)AA等

6、7個(gè)22 nt寡核苷酸序列的電泳遷移率不同，從快到慢依次為7pieA＞ AA＞22R＞4T＞4TMI＞TT＞7pieT。7pieA, AA,22R,4T,4TMI,TT,7pieT序列中A堿基的數(shù)目分別為14，12，8，7，6，2，0。通過相關(guān)性分析我們發(fā)現(xiàn)A堿基的數(shù)目多少與電泳遷移率快慢成正比關(guān)系。由此表明含A堿基較多的序列比含T堿基較多的序列的電泳遷移率要快。
　　然而，在1×TBE和低溫條件的PAGE中，4T序列的電泳遷移率

7、最快，其遷移速度快于15 nt marker的遷移速度;在1×TB-10 mM MgCl2和室溫條件的PAGE中，22R，4T，AA，7pieA和4TMI的電泳遷移率介于22 ntmarkers和19 nt markers之間;在1×TB-10 mM MgCl2和低溫條件的PAGE中，22R，4T，AA，7pieA和4TMI的電泳遷移率介于19 nt markers和15 nt markers之間。
　　5.表達(dá)載體中正義Alu和

8、反義Alu組合活化GFP報(bào)告基因
　　將表達(dá)載體C1-4TMI-Alu×14-CMV-Alu×2(4TMI-Alu-sense-sense)，C1-4TMI-Alu×14-CMV-Alu×2as(4TMI-Alu-sense-antis ense)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染4TMI-Alu-sense-antisense質(zhì)粒的GFP標(biāo)記量是轉(zhuǎn)染4TMI-Alu-sense-sense質(zhì)粒GFP標(biāo)記量的4倍，其

9、中轉(zhuǎn)染4TMI-Alu-sense-antisense質(zhì)粒所產(chǎn)生的GFP標(biāo)記量最高，這表明正義Alu和反義Alu組合可以活化GFP報(bào)告基因，促進(jìn)GFP報(bào)告基因表達(dá)。
　　6.正義Alu和反義Alu組合活化GFP報(bào)告基因具有細(xì)胞種屬來源依賴性
　　將表達(dá)載體C1-4TMI-Alu×14-CMV-Alu×2(4TMI-Alu-sense-sense)，C1-4TMI-Alu×14-CMV-Alu×2as(4TMI-Alu-sen

10、se-antisense)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后，經(jīng)流式檢測可見4TMI-Alu-sense-antisense明顯活化GFP報(bào)告基因，而以上質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，卻沒有見到明顯的基因活化作用。
　　7.正義Alu和反義Alu活化GFP報(bào)告基因具有增強(qiáng)子依賴性
　　無增強(qiáng)子、1個(gè)增強(qiáng)子、2個(gè)增強(qiáng)子表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞誘導(dǎo)的GFP標(biāo)記量之間的比率為1∶3.3∶12.7，此結(jié)果表明表達(dá)載體誘導(dǎo)GFP標(biāo)記量隨著增強(qiáng)子數(shù)目增加

11、而上升。
　　8.正義Alu與反義Alu適當(dāng)搭配活化GFP報(bào)告基因需要足夠多的Alu拷貝數(shù)
　　當(dāng)5'端Alu上游與3'端Alu上游均存在增強(qiáng)子時(shí)，Alu-sense-antisense表達(dá)載體隨著3'端Alu拷貝數(shù)的增加，表達(dá)載體誘導(dǎo)的GFP標(biāo)記量上升。由此可以看出正義Alu與反義Alu適當(dāng)組合活化GFP報(bào)告基因需要足夠多的Alu拷貝數(shù)。
　　9.正義和反義Alu組合在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染條件下才能夠活化GFP報(bào)告基因
　

12、　Alu-sense-sense和Alu-sense-antisense表達(dá)載體在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞48小時(shí)時(shí)GFP標(biāo)記量達(dá)到最高峰，兩組表達(dá)載體所誘導(dǎo)的GFP標(biāo)記量之間沒有明顯的差異。然而Alu-sense-antisense表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeL細(xì)胞24天后開始表現(xiàn)出明顯的活化GFP報(bào)告基因能力，說明正義和反義Alu適當(dāng)組合活化GFP報(bào)告基因必須在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染條件下才能夠?qū)崿F(xiàn)。
　　10.不同物種α珠蛋白基因簇重復(fù)序列分布

13、>　　經(jīng)生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)人類及其他四種動物α珠蛋白基因簇中SINE含量豐富，SINE在α珠蛋白基因簇中分布明顯高于其在β珠蛋白基因簇中分布，α珠蛋白基因簇HBZ基因上下游100kb范圍內(nèi)的SINE基礎(chǔ)頻率明顯高于其在全基因組分布的平均值。這表明SINE在五個(gè)物種的α珠蛋白基因簇中可能發(fā)揮同樣作用，這與α珠蛋白基因表達(dá)可能有關(guān)。
　　11.基因大片段缺失導(dǎo)致的人類血紅蛋白病
　　經(jīng)對人類α珠蛋白基因簇基因缺失數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析

14、發(fā)現(xiàn)，很多類型的基因缺失突變可以導(dǎo)致人類血紅蛋白病，然而在眾多基因缺失病例中，我們發(fā)現(xiàn)唯獨(dú)沒有保留HBA1基因同時(shí)HBA1下游基因大面積缺失的病例。通過國際千人基因組基因數(shù)據(jù)庫(http://browser.1000genomes.org/)查詢了正常人HBA1下游基因變異數(shù)據(jù)，同樣沒有發(fā)現(xiàn)保留HBA1基因但HBA1基因下游基因大面積缺失的數(shù)據(jù)。
　　12.根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究和生物信息學(xué)分析結(jié)果，本文中提出了重復(fù)序列活化基因模型:重復(fù)序

15、列連同其他非編碼序列使基因處于轉(zhuǎn)錄和非轉(zhuǎn)錄的臨界狀態(tài)，重復(fù)序列所起的作用主要是抑制基因表達(dá)，是沉默子，基因一旦轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的重復(fù)序列RNA形成網(wǎng)格(RNA networks)活化基因，形成轉(zhuǎn)錄的正反饋，即轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為輸入激活輸出。
　　結(jié)論:
　　1.AA序列具有增強(qiáng)子活性，能夠活化基因，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。
　　2.AA序列可能通過非典型互補(bǔ)形成不穩(wěn)定莖環(huán)結(jié)構(gòu)，發(fā)揮增強(qiáng)子活性。
　　3.Alu元件正反組合活化基因

16、必須同時(shí)滿足五個(gè)條件，否則引起基因沉默。這五個(gè)條件是:(1)存在正義和反義Alu組合;(2)細(xì)胞種屬來源依賴性:在HeLa中Alu能夠活化基因，在BHK21細(xì)胞中Alu不能活化基因;(3)Alu元件上游必須存在增強(qiáng)子;(4)足夠多的Alu拷貝數(shù);(5)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。提示Alu元件使基因沉默，然而其一旦轉(zhuǎn)錄正反適當(dāng)組合則有活化基因作用。
　　4.提出重復(fù)序列活化基因模型:基因組中的基因處于轉(zhuǎn)錄和非轉(zhuǎn)錄的臨界狀態(tài)，基因一旦轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中