增強子對提高山羊β-酪蛋白調(diào)控序列指導(dǎo)人乳鐵蛋白基因在轉(zhuǎn)基因動物乳腺中特異性表達水平的研究.pdf

1、人乳鐵蛋白(humanlactoferrin)又稱乳轉(zhuǎn)鐵蛋白，是人乳汁中主要的鐵結(jié)合蛋白，廣泛分布于多種組織、體液中，具有提高免疫力，抗菌抑菌，參與鐵代謝等多種生物學(xué)功能，具有廣泛的應(yīng)用前景。從理論上說動物乳腺組織是表達人乳鐵蛋白最為理想的器官。然而，人乳鐵蛋白基因在動物乳腺中高效表達的報道較少。因此，如何提高人乳鐵蛋白基因在動物乳腺中的表達水平是這方面研究的關(guān)鍵。 本文在以前實驗研究的基礎(chǔ)上，選用山羊β-酪蛋白啟動子、外顯子1

2、、外顯子2和內(nèi)含子1共6.7kb大小的序列作為人乳鐵蛋白乳腺特異性表達的調(diào)控序列。用PCR的方法從質(zhì)粒載體上擴增出增強子DNA片段，通過xhol酶切PL18獲得hLTFcDNA片段，共同構(gòu)建了由Chickenβ-globin+山羊β-酪蛋白5'端+增強子+hLTFcDNA+山羊β-酪蛋白3'端組成的人乳鐵蛋白基因乳腺特異表達載體pCL25。 通過制備轉(zhuǎn)基因小鼠驗證所獲得的乳腺特異性表達載體的表達特性。將構(gòu)建的pCL25質(zhì)粒用sa

3、i1與not1限制性內(nèi)切酶消化，回收和純化約18kb的表達載體部分，將回收的片段通過顯微注射法導(dǎo)入小鼠受精卵原核，結(jié)果獲得29只G0代小鼠，經(jīng)PCR檢測，其中1只小鼠整合有外源基因(2＃)。轉(zhuǎn)基因小鼠與正常小鼠交配，出生小鼠經(jīng)PCR篩選，獲得F1代轉(zhuǎn)基因小鼠4只(2公，2母)，F(xiàn)2代轉(zhuǎn)基因小鼠8只(母)。 采用酶聯(lián)免疫法(ELISAassay)和蛋白印跡(WesternBlot)對原代轉(zhuǎn)基因小鼠及其后代的乳汁進行目的蛋白的表達檢

4、測。ELISA檢測結(jié)果表明在轉(zhuǎn)基因小鼠G0和F1、F2代乳汁中人乳鐵蛋白表達均為陽性，表達量約在6～8g/L。WesternBlot結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因小鼠的乳汁中所表達的目的蛋白的分子量大小約為60kDa，小于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子量，相關(guān)原因有待進一步研究。此外，對轉(zhuǎn)基因小鼠血液和唾液中目的蛋白的檢測結(jié)果表明在轉(zhuǎn)基因小鼠血液和唾液中不含有人乳鐵蛋白，說明所獲得的表達載體構(gòu)件具有較強的乳腺特異性。 通過本實驗初步表明，我們所構(gòu)建的人乳鐵蛋