腺病毒介導(dǎo)的突變型人胰島素原基因轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細胞.pdf

1、目的：將人胰島素原基因進行兩個部位的突變，通過腺病毒介導(dǎo)將其轉(zhuǎn)染到人臍帶間充質(zhì)干細胞中，研究其表達分泌人胰島素的能力。 方法：應(yīng)用RT-PCR的方法從健康流產(chǎn)胎兒胰腺組織中擴增pINS的cDNA序列，利用重疊延伸PCR方法對pINS基因在A鏈-C肽和C肽-B鏈的連接處進行兩個部位的突變，產(chǎn)生Furin蛋白酶酶切位點。采用AdEasyTM系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒pAdINS、pAdINS-M2和pAdGFP。分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞，

2、并對其生長特性，免疫表型，分化能力及Furin蛋白酶的表達進行鑒定。pAdlNS、pAdlNS-M2和pAdGFP感染人臍帶間充質(zhì)干細胞后，利用熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測它們的感染效率，并確定最佳的感染復(fù)數(shù)(multiplicities of infection，MOI)。以感染復(fù)數(shù)為100的pAdINS、pAdINS-M2或pAdGFP感染人臍帶間充質(zhì)干細胞1、3、5、7、10天后，RT-PCR檢測人胰島素原基因在人臍帶間充質(zhì)干細胞中

3、表達；Western blot檢測成熟人胰島素和人C-肽在人臍帶間充質(zhì)干細胞中的表達；免疫熒光實驗檢測感染后48小時人胰島素在人臍帶間充質(zhì)干細胞中的表達；ELISA實驗檢測感染后1、3、5、7、10天人胰島素和人C-肽的分泌。 結(jié)果：自健康流產(chǎn)胎兒胰腺組織中擴增出364 bp的pINS cDNA，連接入穿梭質(zhì)粒中，構(gòu)建重組腺病毒。pAdINS-M2經(jīng)擴增純化后滴度達到2．57×1010PFU/mL，pAdINS的滴度為1．25×

4、1010PFU／mL，對照病毒AdGFP為4．85×109PFU／mL。成功的從臍帶組織中分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細胞，繪制生長曲線，約3天擴增一代。細胞周期檢測，大部分細胞都處于G0-G1期(占94．39％)，小部分處于G2-M期(4．15％)和S期(1．45％)。在合適的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，分離培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細胞能夠分化為脂肪細胞和成骨細胞。應(yīng)用RT-PCR方法在人臍帶間充質(zhì)干細胞中檢測到了Furin蛋白酶的存在，表明我們構(gòu)建的含F(xiàn)ur

5、in蛋白酶酶切位點的人胰島素原基因在此細胞中可以被切割產(chǎn)生成熟的人胰島素。通過重組腺病毒pAdINS、pAdINS-M2和pAdGFP以不同感染復(fù)數(shù)感染人臍帶間充質(zhì)干細胞，利用熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測感染效率，確定MOI 100為最佳的感染復(fù)數(shù)。以MOI=100的pAdINS、pAdINS-M2或pAdGFP感染人臍帶間充質(zhì)干細胞1、3、5、7、10天后，RT-PCR方法檢測到在pAdINS和pAdINS-M2感染的UC-MSCs中人

6、胰島素原基因都有表達：Western blot的結(jié)果顯示pAdINS感染的UC-MSCs表達人胰島素原，而pAdINS-M2感染的UC-MSCs中檢測到了人胰島素和C-肽，pAdGFP感染的UC-MSCs中兩者都沒有檢測到表達。免疫熒光也檢測了pAdINS-M2感染后48小時人胰島素和C-肽在人臍帶間充質(zhì)干細胞胞漿中表達；ELISA檢測感染后1、3、5、7、10天培養(yǎng)上清中人胰島素和C-肽的濃度。結(jié)果顯示，自感染后24小時目的基因就開始