腺病毒介導(dǎo)BMP-2基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)性多能間充質(zhì)干細(xì)胞成骨方向的研究.pdf

1、背景和目的：
　　各種原因造成的骨組織缺損是臨床常見疾患，隨著骨組織工程技術(shù)的興起，給傳統(tǒng)治療難點(diǎn)的骨缺損帶來(lái)了一些曙光，組織工程利用自體細(xì)胞的生物活性，給予外在因素特定的干擾下將其誘導(dǎo)分化為所需的細(xì)胞，從而達(dá)到修復(fù)組織的能力。傳統(tǒng)的間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞已在體外成功被誘導(dǎo)定向分化，但涉及到一些倫理、取材限制等問題，因此其在組織學(xué)上作為種子方面的研究受到一定的限制；而隨著體內(nèi)體細(xì)胞的研究，通過使用幾個(gè)特定的轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)體細(xì)胞的重

2、編程而獲得的可不斷自我更新且具有多向分化潛能的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)的出現(xiàn)，可作為組織學(xué)中理想的種子細(xì)胞，本課題在前期已成功將人、山羊、大鼠成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為 iPSCs的基礎(chǔ)上，運(yùn)用誘導(dǎo)因子將山羊 iPSCs定向分化為iPSCs-MSC，作為骨組織工程的優(yōu)化種子細(xì)胞，然后利用體外構(gòu)建腺病毒搭載生物因子BMP-2，從而去轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)iPSCs-MSC，探討載體介導(dǎo)下種子細(xì)

3、胞轉(zhuǎn)染的可行性，同時(shí)觀察研究iPSCs-MSC在生物因子BMP-2的作用下，對(duì)其體外增殖和分化成骨能力的影響。
　　方法：
　　1.體外擴(kuò)增預(yù)先構(gòu)建好的iPSCs-MSC，取傳代至第三代的iPSCs-MSC，按照普通培養(yǎng)基、含BMP-2的培養(yǎng)基、腺病毒-BMP-2的培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行體外繁殖，而分別設(shè)定為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，然后分別往各組加入成骨誘導(dǎo)液，在體外進(jìn)行培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7d用CCK-

4、8試劑檢測(cè)iPSCs-MSC的存活及增殖活性；
　　2.三組處理好的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后，分別于3、7、14天后終止培養(yǎng)，利用堿性磷酸酶試劑盒檢測(cè)其堿性磷酸酶表達(dá)情況；
　　3.然后在三組細(xì)胞培養(yǎng)增殖至20天后，使用茜素紅染液，然后分別于染色后1周、2周后用光學(xué)顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)的形成；
　　4.使用 Western Blotting法測(cè)定三組細(xì)胞，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后BMP-2的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.CCK-8

5、檢測(cè)后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的可見光吸收度 OD高于另外兩項(xiàng)對(duì)照組，說明實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞增殖能力活性明顯強(qiáng)于另外兩組；
　　2.腺病毒轉(zhuǎn)染后的三組細(xì)胞ALP測(cè)定呈陽(yáng)性反應(yīng)，且細(xì)胞內(nèi)ALP活性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但是實(shí)驗(yàn)組中ALP含量明顯高于另外兩組，同時(shí)隨著時(shí)間延長(zhǎng)，陰性對(duì)照組較空白對(duì)照組也表現(xiàn)出強(qiáng)ALP表達(dá)能力；
　　3.實(shí)驗(yàn)組紅色礦化結(jié)節(jié)含量明顯，陰性對(duì)照組礦化結(jié)節(jié)表達(dá)稍高于空白對(duì)照組，空白對(duì)照組未見明顯紅色結(jié)節(jié)；
　　4.各

6、組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞BMP-2表達(dá)明顯高于陰性對(duì)照組，陰性對(duì)照組表達(dá)不明顯，空白對(duì)照組未見表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1．證實(shí)了iPSC-MSCs在體外成骨的可行性；
　　2.說明了體外生物因子BMP-2具有能顯著促進(jìn)iPSC-MSCs向成骨細(xì)胞的分化和功能；
　　3．腺病毒能明顯加快體外BMP-2對(duì)iPSC-MSCs向成骨細(xì)胞的分化速率；
　　4．BMP-2基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)性多能間充質(zhì)干細(xì)胞后在體外可明顯促進(jìn)