雙突變型HIF1α腺病毒構(gòu)建及其對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和向心肌細(xì)胞分化的影響.pdf

1、心血管疾病仍然是人體健康的一大殺手。近年來研究發(fā)現(xiàn)，成人心臟存在心肌有絲分裂和心肌前體細(xì)胞，但心肌細(xì)胞的大量死亡還是會(huì)發(fā)生心力衰竭，再生藥物治療成為退行性疾病最有潛力的治療方法。 干細(xì)胞因?yàn)橛休^好的可塑性而成為現(xiàn)代科學(xué)研究的焦點(diǎn)。由于MSC容易獲得，具有自我復(fù)制能力，不會(huì)受到倫理學(xué)的限制，在體外粘附培養(yǎng)并不斷擴(kuò)增，以及最近報(bào)道的具有向心肌細(xì)胞分化的潛能。MSC被認(rèn)為是最有希望用來恢復(fù)損傷心肌的再生細(xì)胞。 已有大量研究表明

2、， MSC能夠明顯改善心功能，其中可能的原因是MSC向心肌細(xì)胞分化，使得有功能的心肌細(xì)胞增多，從而增加心肌收縮力。體外研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞一細(xì)胞間的物理接觸或心肌細(xì)胞微環(huán)境可以促進(jìn)MSC向心肌細(xì)胞分化，但是，究竟是什么在MSC向心肌細(xì)胞分化過程中起決定性作用，目前并不清楚。 在心?；蛐乃?dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，MSC能向心肌細(xì)胞分化。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過低氧/復(fù)氧處理的心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)基能夠誘導(dǎo)MSC表達(dá)MHC和TnT等心肌標(biāo)志物。這些情況下

3、，MSC向心肌細(xì)胞分化都是在低氧環(huán)境中發(fā)生，低氧環(huán)境可能與MSC向心肌細(xì)胞分化有關(guān)。同時(shí)，Linask及其同事證明心肌細(xì)胞分化是在低氧環(huán)境中發(fā)生。低氧環(huán)境是否會(huì)促進(jìn)MSC向心肌細(xì)胞分化，其分子機(jī)制怎樣并不清楚。 低氧環(huán)境下，會(huì)產(chǎn)生一種重要的轉(zhuǎn)錄激活因子HIF-1，它的半衰期大約5分鐘。HIF-1能激活多種因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，其中也包括TGF-β。 TGF-β是一類具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、發(fā)育和

4、凋亡等多種生命活動(dòng)，現(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1能誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。 近年來發(fā)現(xiàn)，Smads蛋白家族是介導(dǎo)TGF-β家族的下游信號(hào)通道蛋白，TGF-β1通過Smad4誘導(dǎo)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。但在MSC與CMC共培養(yǎng)中TGF-β1/Smad4是否被激活并參與MSC向CMC分化?目前國內(nèi)外尚無文獻(xiàn)報(bào)道。 本研究的目的是采用攜帶HIF-1α基因的腺病毒，研究HIF-1α對(duì)MSC增殖和與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)的MSC的影響，

5、探討MSC向心肌細(xì)胞分化可能的分子機(jī)制，觀察TGF-β1/Smad4信號(hào)通路在其中的作用。研究結(jié)果將為低氧環(huán)境對(duì)MSC向心肌細(xì)胞分化的影響奠定理論基礎(chǔ)，為HIF-1α基因治療和MSC移植治療在臨床的應(yīng)用提供理論依據(jù)。為此我們?cè)O(shè)計(jì)并完成了以下實(shí)驗(yàn)。 目的：采用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建攜帶雙突變型HIF-1α的腺病毒，研究Ad-HIF1α．Ala402-Ala564對(duì)MSC增殖的影響，以及HIF-1α對(duì)與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)的MSC向心肌細(xì)胞分

6、化的影響。 方法：采用定點(diǎn)突變技術(shù)及體外連接方法重組腺病毒Ad-HIF1α-Ala402-Ala564，TICD50法測(cè)定病毒滴度，Westem鑒定Ad-HIF1α的功能；第二部分，實(shí)驗(yàn)分為三組：HIF-1α組(MSC+Ad-HIF1α)、LacZ組(MSC+Ad—LacZ)、Control組(MSC+PBS)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，計(jì)數(shù)病毒(MOI=330)感染后1、2、4、7、10、15天各組的MSC數(shù)目；第三部分，實(shí)驗(yàn)分為四組：

7、HIF-1α組(MSC+CMC+Ad．HIF1α)、LacZ組(MSC+CMC+Ad-LacZ)、Sham組(MSC+CMC+PBS)、MSC+HIF-1α組(MSC+Ad-HIF1α)，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，按MSC：CMC為1：2的比例共培養(yǎng)MSC和OCMC，共培養(yǎng)24小時(shí)后感染病毒(MOI=100)，病毒感染后7天，免疫細(xì)胞化學(xué)分析共培養(yǎng)的MSC表達(dá)心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物cTnT的情況，RT-PCR分析各組細(xì)胞HIF-1α、TGF-β1、

8、Smad4、NKx2.5、GATA-4的mRNA表達(dá)量，并做細(xì)胞分化率與他們之間的相關(guān)分析。 結(jié)果： pShuttle2-HIF1α-Ala564質(zhì)粒上的定點(diǎn)突變成功(Pro-402突變?yōu)锳la-402)，構(gòu)建了表達(dá)HIF-1α蛋白的高滴度重組腺病毒Ad-HIF-α-Ala402-Ala564，滴度達(dá)2×109PFU/ml，與Ad-HIF1α．Ala564和Ad-LacZ相比，它使HIF-1α蛋白的穩(wěn)定性和表達(dá)量增加，分別為p＜

9、0.05和p＜0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。病毒以MOI值為330感染MSC時(shí)，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，在感染后第7天，HIF-1α組較Control組能明顯促進(jìn)MSC增殖，p＜0.05；LacZ組較Control組相比細(xì)胞數(shù)目少，p＜0.05，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且，HIF-1α增加共培養(yǎng)的MSC向CMC分化，其分化率可達(dá)32.68±6.52％，而LacZ組和Sham組僅為8.28±0.09％和10.25±2.20％，單純MSC組僅0.32±0

10、.05％，HIF1α組與LacZ組和Sham組相比，p值均小于0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，LacZ組和Sham組間無顯著性差異，MSC組與Sham組相比，p＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。做相關(guān)分析得到，HIF-1 α、TGF-β1、Smad4、NKx2.5、GATA-4的mRNA水平與心肌細(xì)胞分化率的決定系數(shù)R2分別為：0.8543、0.7059、0.7882、0.8083、0.7736。 結(jié)論：HIF-1α的Pro-402突變后，