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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:克隆內(nèi)蒙古白絨山羊 VEGF基因,構(gòu)建毛囊特異性表達(dá)載體pCDsRed2-KV,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞,篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白和毛囊特異表達(dá)VEGF的轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞克隆。檢測(cè)VEGF基因在皮膚細(xì)胞中的表達(dá)。此外本研究嘗試發(fā)現(xiàn)新的剪接變體。檢測(cè)VEGF138是否存在于內(nèi)蒙古白絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞中,檢測(cè)內(nèi)蒙古白絨山羊腦、心臟、肝、脾、腎、肺6種組織中VEGF164、VEGF138和VEGF120三種剪接變體的mRNA豐度。
2、
方法:采用RT-PCR技術(shù)克隆內(nèi)蒙古白絨山羊VEGF基因 cDNA,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。以pCDsRed2載體為基本骨架將VEGF164基因cDNA序列亞克隆到 KAP6-1啟動(dòng)子下游,接續(xù)連接紅色熒光蛋白表達(dá)元件 DsRed,構(gòu)建VEGF164基因毛囊特異表達(dá)載體pCDsRed2-KV。外源表達(dá)載體以lipofectamine TM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細(xì)胞,G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆,PCR鑒定外源基因
3、在細(xì)胞基因組中的整合。pCDsRed2-KV載體轉(zhuǎn)染內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞,RT-PCR檢測(cè)VEGF mRNA表達(dá)量,Western blot檢測(cè)VEGF蛋白的表達(dá)。利用Taqman探針熒光實(shí)時(shí)定量方法確認(rèn)新發(fā)現(xiàn)的剪接變體VEGF138存在于內(nèi)蒙古白絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞中。采用SYSR Green熒光實(shí)時(shí)定量檢測(cè)VEGF164、VEGF138和VEGF120三種剪接變體在內(nèi)蒙古白絨山羊6中組織中的mRNA豐度。
結(jié)果
4、:克隆到內(nèi)蒙古白絨山羊VEDF基因的三個(gè)剪接變體VEGF164、VEGF138和VEGF120的cDNA序列,其中VEGF138是首次發(fā)現(xiàn)。VEGF164cDNA序列573bp,包含了全長(zhǎng)ORF,編碼190個(gè)氨基酸,N端的26個(gè)堿基為信號(hào)肽序列;VEGF138 cDNA序列495bp,包含了全長(zhǎng)ORF,編碼164個(gè)氨基酸,N端的26個(gè)堿基為信號(hào)肽序列;VEGF120 cDNA序列441bp,包含了全長(zhǎng)ORF,編碼146個(gè)氨基酸,N端的2
5、6個(gè)堿基為信號(hào)肽序列。VEGF164、VEGF138和VEGF120三種剪接變體在內(nèi)蒙古白絨山羊腦、心臟、肝、脾、腎、肺組織中均有表達(dá),但VEGF138的mRNA豐度遠(yuǎn)小于VEGF165和VEGF120。測(cè)序結(jié)果顯示表達(dá)載體pCDsRed2-KV中,VEGF164基因正確連接在毛囊特異性啟動(dòng)子 KAP6-1下游,順序連接CMV啟動(dòng)子和紅色熒光蛋白基因,載體構(gòu)建正確。篩選得到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆,PCR檢測(cè)顯示外源KAP6-1啟動(dòng)子和VEGF1
6、64基因整合到細(xì)胞基因組中。轉(zhuǎn)染VEGF基因的內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚細(xì)胞中,VEGFmRNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)量均有明顯增加。
結(jié)論:成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白和毛囊特異表達(dá) VEGF164的真核表達(dá)載體,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞,并為進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)獲得毛囊特異性超表達(dá)VEGF164基因絨山羊新品系提供了條件。VEGF基因在內(nèi)蒙古白絨山皮膚細(xì)胞中表達(dá)為轉(zhuǎn)基因絨山羊新品系建立提供了理論基礎(chǔ)。VEGF基因在內(nèi)蒙古白絨
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