外源基因VEGF在轉(zhuǎn)基因絨山羊中的表達(dá)和遺傳穩(wěn)定性研究.pdf

1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial cell growth factor，VEGF)，是一種可以在動(dòng)物毛囊中表達(dá)的毛乳頭細(xì)胞自分泌生長(zhǎng)因子。研究表明，VEGF基因可以在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生，對(duì)于動(dòng)物毛囊發(fā)育和毛發(fā)生長(zhǎng)起重要作用。因此本實(shí)驗(yàn)室選擇VEGF基因作為外源基因?qū)Π柊退拱捉q山羊進(jìn)行轉(zhuǎn)基因培育，期望獲得高產(chǎn)絨量的轉(zhuǎn)基因絨山羊，并為進(jìn)一步探索VEGF基因在動(dòng)物體內(nèi)的作用機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　本實(shí)驗(yàn)室近年來

2、通過體細(xì)胞克隆技術(shù)獲得的VEGF轉(zhuǎn)基因絨山羊中，有羊絨產(chǎn)量顯著提高和羊絨產(chǎn)量未出現(xiàn)明顯改善的轉(zhuǎn)基因絨山羊，并且成年轉(zhuǎn)基因絨山羊通過有計(jì)劃的配種產(chǎn)生了子代羊。本實(shí)驗(yàn)選擇了一只產(chǎn)絨量顯著提高的轉(zhuǎn)基因絨山羊（1號(hào)）及其兩只子代（2號(hào)、3號(hào)）和一只產(chǎn)絨量未見明顯改善的轉(zhuǎn)基因絨山羊（4號(hào)）及其兩只子代（5號(hào)、6號(hào)）進(jìn)行檢測(cè)，并與來自于同一細(xì)胞系的體細(xì)胞克隆絨山羊（7號(hào)）進(jìn)行對(duì)比，確定外源VEGF基因在不同代次轉(zhuǎn)基因絨山羊體內(nèi)的遺傳效率、表達(dá)量，為

3、深入探索外源基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的遺傳規(guī)律提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　本實(shí)驗(yàn)從DNA、RNA、蛋白質(zhì)三個(gè)水平對(duì)轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如下:
　　(1)通過PCR鑒定，1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)羊呈轉(zhuǎn)基因陽性。5號(hào)、6號(hào)羊呈轉(zhuǎn)基因陰性。
　　(2)使用Glucagon基因作為內(nèi)參、絕對(duì)定量PCR法對(duì)外源VEGF基因拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線公式:log2N=-0.3879ΔCt+0.3122(R2=0.9978, p＜0.00

4、1)計(jì)算得到各轉(zhuǎn)基因絨山羊的外源基因拷貝數(shù)分別為:1號(hào)，1.235;2號(hào)，0.977;3號(hào)0.962;4號(hào)，1.884。1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)羊外源基因?yàn)閱慰截悾?號(hào)羊?yàn)殡p拷貝。
　　(3)以GAPDH基因作為內(nèi)參，使用Real-time-PCR和western blot對(duì)外源基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與7號(hào)體細(xì)胞克隆羊相比，轉(zhuǎn)基因絨山羊皮膚組織中外源VEGF基因mRNA及蛋白表達(dá)量分別是:1號(hào)，3.53倍、2.93倍;2號(hào)，2.7

5、8倍、2.56倍;3號(hào)，0.95倍、1.24倍;4號(hào)，1.23倍、1.03倍;5號(hào)，0.78倍、0.96倍;6號(hào)，1.02倍、0.72倍。轉(zhuǎn)基因絨山羊血液中外源VEGF基因mRNA及蛋白表達(dá)量分別是:1號(hào)，0.57倍、0.98倍;2號(hào)，0.78倍、0.87倍;3號(hào)，0.69倍、1.12倍;4號(hào)，0.32倍、0.94倍;5號(hào)，0.91倍、1.12倍;6號(hào)，0.89倍、0.83倍。
　　以上結(jié)果顯示，外源VEGF基因在轉(zhuǎn)基因絨山羊中的