絨山羊絨毛周期相關(guān)microRNA及其靶基因的研究.pdf

1、內(nèi)蒙古絨山羊是自治區(qū)地方優(yōu)質(zhì)資源品種，絨毛生產(chǎn)性能是內(nèi)蒙古絨山羊的重要經(jīng)濟(jì)性狀。影響絨毛生長(zhǎng)的因素有很多，而褪黑激素、miRNA是其中兩個(gè)非常重要的因素。近年來(lái)，關(guān)于褪黑激素影響絨山羊絨毛生長(zhǎng)的研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)埋植褪黑素可促進(jìn)羊絨提前進(jìn)入生長(zhǎng)期，誘發(fā)2次生絨并在分子水平改變了很多絨毛生長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)，而對(duì)于miRNA這一重要毛發(fā)生長(zhǎng)調(diào)控因子的研究未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。因此，本研究以miRNA為介導(dǎo)，通過(guò)microRNA靶基因指紋圖譜、實(shí)時(shí)熒光定

2、量PCR、RNA-seq等試驗(yàn)手段，建立外源褪黑激素、miRNA及其靶基因的關(guān)系，進(jìn)一步從分子水平上的解析褪黑激素促進(jìn)絨毛生長(zhǎng)的機(jī)理，為提高絨毛產(chǎn)量和品質(zhì)提供理論依據(jù)。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1、microRNA靶基因指紋圖譜(MTFP)方法的建立
　　建立了一種實(shí)驗(yàn)性獲得miRNA靶基因的新方法(microRNA Targets FingerPrint，MTFP)。該方法在設(shè)定上游種子序列的互補(bǔ)序列和下游錨定序

3、列的基礎(chǔ)上添加特殊接頭，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄和特殊二步PCR將microRNA的靶基因擴(kuò)增;擴(kuò)增后的microRNA靶基因在聚丙烯酰胺凝膠電泳中檢測(cè)其片段大小和表達(dá)豐度，用于篩選在不同生理狀態(tài)或試驗(yàn)條件下特異表達(dá)的基因;特定的靶基因序列通過(guò)DNA回收和測(cè)序方法得到。以miR-203為例，在不同生理狀態(tài)的山羊皮膚樣品中獲得了5條大小分別為718 bp(JN709494)、349bp(JN709495)、243bp(JN709496)、156bp(J

4、N709497)和97bp(JN709498)的靶基因序列。其中JN709494，JN709497，JN709498分別為MBNL1、ZKSCAN1、SLC7A60S的同源基因。MTFP經(jīng)濟(jì)適用、可操作性強(qiáng)，可用于探索microRNA調(diào)節(jié)的靶基因，或用來(lái)評(píng)估靶基因的表達(dá)譜特征。
　　2、褪黑激素影響miRNA及其靶基因的研究
　　埋植褪黑激素明顯改變了6個(gè)絨毛相關(guān)miRNA的表達(dá)規(guī)律。一個(gè)絨毛周期內(nèi)，除let-7外，miRN

5、A的表達(dá)量發(fā)生三次躍遷。對(duì)照組中miR-203、miR-205、let-7、miR-96、miR-183均是8、9月份以較低水平基本保持不變，10月開(kāi)始上升，11月達(dá)到全年的最高水平后急劇下降，并于2月、6月又出現(xiàn)兩個(gè)小的表達(dá)高峰; miR-205表達(dá)規(guī)律與其余5個(gè)miRNA基本一致，一個(gè)絨毛周期內(nèi)也出現(xiàn)3個(gè)表達(dá)高峰，全年表達(dá)量最高值出現(xiàn)在12月。埋植組中miR-203、miR-205出現(xiàn)3個(gè)明顯的表達(dá)高峰，分別是10月、12月、2月，

6、miR-203全年表達(dá)最高值出現(xiàn)在10月，miR-205則位于2月;miR-96、miR-199a全年內(nèi)在10月、12月、2月雖然也出現(xiàn)了三個(gè)峰值，但除了10月達(dá)到全年最高水平外，其余兩個(gè)峰值波動(dòng)不明顯;miR-183埋植褪黑激素后全年處于較低水平。
　　埋植褪黑激素改變了miRNA之間的共表達(dá)模式。對(duì)照組各miRNA之間相關(guān)系數(shù)范圍為0.87-0.99，均大于0.85，與對(duì)照組相比，埋植組中l(wèi)et-7a與miR-96、miR-1

7、99a、miR-205,miR-203與miR-96、miR-199a, miR-96與miR-183,miR-183與miR-199a之間的相似性被明顯消弱。
　　MTFP并未檢測(cè)到埋植前后特異條帶的分布，但定性的分析了候選miRNA的靶基因。
　　3、埋植組與對(duì)照組10月皮膚組織轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序分析
　　在構(gòu)建內(nèi)蒙古絨山羊10月皮膚埋植組與對(duì)照組轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了illumina高通量測(cè)序，共獲得8千多萬(wàn)

8、條100bp的reads，從頭組裝得到了60，565條contigs，contigs的平均長(zhǎng)度為656bp，N50為860bp，最長(zhǎng)的contigs為19，346bp。大于300bp的contigs52，331條。通過(guò)CLCgenomicWorkbench6.0的RNAseq分析篩選到fold_change(MT-10/C-10)＞4、Q-value＜0.001或fold_change(MT-10/C-10）＜-4、Q-value＜0.

9、001的差異contigs465條，其中393條contigs序列顯著上調(diào)，72條contigs序列顯著下調(diào)，420條contigs在NR數(shù)據(jù)庫(kù)具有注釋信息。對(duì)這些差異基因進(jìn)行GO分類(lèi)和KEGG通路分析，上調(diào)基因富集到發(fā)育相關(guān)的16條通路，包括黏著斑連接、細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控、TGF-β信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路等16個(gè)pathways。下調(diào)基因未發(fā)現(xiàn)顯著性富集通路。
　　4、褪黑激素介導(dǎo)miRNA候選靶基

10、因的研究2@為了進(jìn)一步研究褪黑激素、miRNA及其靶基因的關(guān)系。本研究首先基于10月轉(zhuǎn)錄組contigs數(shù)據(jù)，利用miranda3.0軟件預(yù)測(cè)得到7個(gè)miRNA介導(dǎo)調(diào)控16750條contigs序列。通過(guò)埋植組與對(duì)照組RPKM值比較篩選到Q value＜0.05且|Fold_change|≥2的contigs912條。結(jié)合本研究實(shí)驗(yàn)獲得的miRNA靶基因數(shù)據(jù)，確定miR-203及靶基因DOST，let-7a及靶基因LYPLA1、ND4，