利用TALENs技術制備METN基因敲除的阿爾巴斯絨山羊.pdf

1、肌肉生成抑制素(Myostatin，MSTN)是骨骼肌生長發(fā)育的一個重要的負調(diào)控因子，是轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族的成員之一，具有抑制肌肉分化和生長的作用。研究表明通過遺傳操作降低MSTN基因的表達能加速肌肉生長并增加產(chǎn)肉量。本研究首先構建了針對MSTN基因的TALENs載體，并利用標記蛋白表達載體優(yōu)化了絨山羊胎兒成纖維細胞的脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染條件，然后利用最優(yōu)的轉(zhuǎn)染條件將TALENs載體導入阿爾巴斯白絨山羊胎兒成纖維細胞中，挑取轉(zhuǎn)

2、染后的單個細胞培養(yǎng)，建立單克隆細胞系，通過PCR鑒定篩選出MSTN+/-和MSTN-/-兩種基因型的細胞系。選擇MSTN-/-基因型的細胞通過體細胞核移植(Somatic cell nuclear transfer，SCNT)的方法制備胚胎，移植受體后生產(chǎn)基因敲除的絨山羊。
　　1、絨山羊胎兒成纖維細胞共轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化
　　利用脂質(zhì)體法將紅色熒光蛋白表達載體pCMV-DsRed質(zhì)粒和綠色熒光蛋白表達載體pEGFP-C1質(zhì)粒共

3、同導入絨山羊胎兒成纖維細胞中，篩選最優(yōu)的轉(zhuǎn)染條件。在轉(zhuǎn)染48h后，倒置熒光顯微鏡下可以觀察到大量表達紅色熒光和綠色熒光的陽性細胞并且細胞生長狀態(tài)良好。通過流式細胞儀進行分析，發(fā)現(xiàn)最高的共轉(zhuǎn)染率為24.5％。對應的最優(yōu)共轉(zhuǎn)染條件為:每1×105個絨山羊胎兒成纖維細胞加入脂質(zhì)體3μL，pCMV-DsRed和pEGFP-C1的質(zhì)粒量各250ng。
　　2、利用TALENs技術制備MSTN基因敲除絨山羊胎兒成纖維細胞
　　本實驗采用

4、“單元組裝法”通過酶切連接將四單元模塊和三單元模塊進行拼接，成功構建出一對TALENs載體。采用最適的轉(zhuǎn)染條件，將TALENs載體bMK（包括S1586-PEAS、S1586-PERR兩個質(zhì)粒）導入阿爾巴斯絨山羊胎兒成纖維細胞中，隨機挑取單個細胞培養(yǎng)，建立單克隆細胞系。設計橫跨打靶位點的引物對每個單克隆細胞系的基因組進行PCR擴增，并對PCR產(chǎn)物進行測序，篩選出靶位點發(fā)生突變的單克隆細胞系。本研究共進行了三次打靶實驗，共獲得160個單克

5、隆細胞系，其中有20個單等位基因敲除和3個雙等位基因敲除的陽性單克隆細胞系，總敲除效率為14.38％。選取其中一株雙等位基因敲除細胞系D4進行染色體數(shù)目分析，檢測正常率為90％(27/30)。本研究選擇D4細胞系作為供體細胞通過體細胞核移植的方法生產(chǎn)MSTN基因敲除絨山羊。
　　3、MSTN基因敲除絨山羊的生產(chǎn)
　　取屠宰山羊卵巢，切割法采卵，體外培養(yǎng)18h，利用盲吸法去除卵母細胞的細胞核，分別將MSTN-/-型和WT型細胞

6、系作為供體細胞移入去核的卵母細胞中，融合、激活后進行體外發(fā)育培養(yǎng)。我們采用電融合法進行融合，融合率分別為74.59％、71.2％;用IA23187和6-DMAP進行融合卵的激活，用發(fā)育液進行體外培養(yǎng)，48h后統(tǒng)計卵裂率分別為65.54％、65.9％。本研究通過體細胞核移植技術共獲得738枚MSTN-/-型重構胚胎和723枚WT型重構胚胎。將其中363枚卵裂的MSTN-/-克隆胚胎通過手術法移植入自然發(fā)情第三天的84只受體母羊的輸卵管中。