TSA和SAHA對(duì)阿爾巴斯白絨山羊脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞分化的影響.pdf

1、目前，體細(xì)胞核移植技術(shù)(somatic cell nuclear transfer, SCNT)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備、瀕危珍稀動(dòng)物保護(hù)等方面發(fā)揮著重要作用。然而，該技術(shù)中，作為核供體的體細(xì)胞具有較高分化程度，使得其不能完全被卵母細(xì)胞重編程，進(jìn)而導(dǎo)致克隆胚胎存在死亡率高、發(fā)育率低等問題。研究表明，克隆胚胎表觀遺傳重編程的異常，是導(dǎo)致核移植技術(shù)生產(chǎn)效率低的重要原因。因此，研究人員逐漸傾向于利用分化程度更低的多能性干細(xì)胞作為克隆技術(shù)的供體細(xì)胞。然

2、而，目前家畜胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng)還沒有獲得成功，因此還無法應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因家畜的制備。因此，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)作為一類成體干細(xì)胞，具有較低的分化程度和多向分化的潛能，且易于體外培養(yǎng)，在家畜轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域越來越受到關(guān)注。
　　脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞以其來源豐富、易于培養(yǎng)以及具有多向分化潛能等優(yōu)點(diǎn)，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)、細(xì)胞治療及組織工程中具有廣泛的應(yīng)用前景。已有報(bào)道顯示，脂肪間充質(zhì)干細(xì)

3、胞(Adipose-Derived Stem Cells，ADSCs)作為供體細(xì)胞進(jìn)行核移植，可以有效提高克隆胚胎的發(fā)育率。本研究以阿爾巴斯白絨山羊脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(goat Adipose-Derived Stem Cells，gADSCs)為研究對(duì)象，探討曲古菌素A(Trichostatin A，TSA)和伏立諾他(Vorinostat，SAHA)兩種組蛋白去乙酰化酶抑制劑(Histone deacetylase inhibitor

4、, HDACi)對(duì)其組蛋白乙酰化修飾、多能性及分化的調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步將該細(xì)胞應(yīng)用于高效生產(chǎn)克隆和轉(zhuǎn)基因絨山羊等相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。
　　一、TSA和SAHA處理對(duì)gADSCs組蛋白H3K9乙?；饔?br>　　1、gADSCs生長(zhǎng)曲線的繪制
　　根據(jù)連續(xù)7天細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)gADSCs的生長(zhǎng)符合細(xì)胞生長(zhǎng)的“S”規(guī)律，生長(zhǎng)速度較快，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。
　　2、TSA和SAHA處理對(duì)gADSCs增殖活性的影響

5、r>　　分別用500nM TSA和16μM SAHA處理gADSCs24h、48h和72h，利用MTT法分析對(duì)照組、TSA與SAHA處理組的細(xì)胞活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSA與SAHA處理24h細(xì)胞增殖活性最高，隨處理時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞增殖活性逐漸下降。
　　3、免疫熒光和Western blot檢測(cè)gADSCs組蛋白H3K9乙?；阶兓?br>　　500nM TSA和16μM SAHA分別處理gADSCs24h。免疫熒光結(jié)果顯示，細(xì)胞中組蛋白

6、H3K9乙?；療晒庑盘?hào)強(qiáng)度顯著高于未處理的對(duì)照組。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，組蛋白H3K9乙?；斤@著升高，且TSA比SAHA的作用效果更加明顯(P＜0.01)。結(jié)果表明，TSA和SAHA處理，能使組蛋白H3K9高度乙?；?。
　　4、Q-PCR和Western blot檢測(cè)gADSCs中HDACs表達(dá)情況
　　Q-PCR檢測(cè)HDACs轉(zhuǎn)錄水平顯示，與未處理的對(duì)照組細(xì)胞相比，500nMTSA和16μM SAHA分

7、別處理gADSCs24h，HDAC1和HDAC6的轉(zhuǎn)錄水平升高;TSA使gADSCs中SIRT1的轉(zhuǎn)錄升高，而SAHA卻使其轉(zhuǎn)錄下降。Westernblot檢測(cè)gADSCs中HDACs表達(dá)情況，TSA和SAHA使HDAC1和HDAC6的表達(dá)顯著提高，SIRT1的表達(dá)水平顯著下降(P＜0.01)。
　　二、TSA和SAHA上調(diào)組蛋白H3K9乙?；綄?duì)gADSCs增殖、凋亡和多能性相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　1、TSA和SAHA處

8、理引起gADSCs細(xì)胞周期停滯和凋亡
　　流式細(xì)胞儀檢測(cè)500nM TSA和16μM SAHA分別處理gADSCs24h的細(xì)胞周期分布與凋亡情況，發(fā)現(xiàn)TSA和SAHA處理阻斷gADSCs細(xì)胞周期，使細(xì)胞停滯在G0/G1期，并且顯著發(fā)生早期凋亡。
　　2、Q-PCR檢測(cè)TSA和SAHA處理后gADSCs增殖、凋亡和多能性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化
　　Q-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，處理后的細(xì)胞中NANOG、OCT4、SOX2多能性基因

9、轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。增殖相關(guān)基因TERT轉(zhuǎn)錄水平升高，PCNA轉(zhuǎn)錄水平降低。而凋亡相關(guān)基因P53和BAX的轉(zhuǎn)錄均顯著降低。
　　3、Western blot檢測(cè)TSA和SAHA處理后gADSCs增殖、凋亡和多能性相關(guān)基因的蛋白水平變化
　　Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，處理后的細(xì)胞中NANOG、OCT4多能性基因在蛋白質(zhì)水平表達(dá)量升高，SOX2表達(dá)降低。而增殖相關(guān)基因TERT和PCNA，凋亡相關(guān)基因P53均顯著降低，B

10、AX顯著升高。
　　三、TSA和SAHA上調(diào)組蛋白H3K9乙?；綄?duì)gADSCs向脂肪細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞分化的影響
　　1、TSA和SAHA處理對(duì)于gADSCs向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響
　　通過體外脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組細(xì)胞正常分化為脂肪細(xì)胞，表明分化體系健全。在脂肪細(xì)胞分化過程中，TSA和SAHA處理可以提高脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，其中脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ2(PPARG2)顯著升高

11、。通過油紅O染色與脂滴定量顯示，TSA和SAHA促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化。
　　2、TSA和SAHA處理對(duì)于gADSCs向神經(jīng)分化的影響
　　免疫熒光法檢測(cè)對(duì)照組細(xì)胞正常分化為神經(jīng)細(xì)胞，表明神經(jīng)分化體系可靠。在體外神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)研究過程中，TSA和SAHA促進(jìn)神經(jīng)分化關(guān)鍵基因ENO2和NeuN的轉(zhuǎn)錄。
　　綜上所述，本研究使用TSA和SAHA處理阿爾巴斯白絨山羊脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞降低了組蛋白去乙?；傅幕钚?，促使組蛋白H3K9乙酰