利用TALENs技術構建zfol基因的斑馬魚突變體.pdf

1、凝集素廣泛存在于動、植物體內,具有多種生物活性,在魚類胚胎發(fā)育早期,各組織還未完全發(fā)育之時,對外界病原體仍然有一定的抵御能力,這種抵御能力來自自身非特異性免疫和母源性免疫,而存在于卵母細胞中的凝集素等物質被認為是來自母體的免疫物質,并且極有可能在魚類胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用(王志平,2008)。對母源凝集素的研究,有利于對凝集素在魚類胚胎發(fā)育過程中所扮演的角色進行深入了解,以期為魚類免疫機制的研究奠定基礎。
　　在本研究中,首先

2、我們克隆得到了斑馬魚母源凝集素基因zfol,cDNA全長為937bp,包含一個771bp的開放閱讀框(ORF),編碼256個氨基酸,長73bp的5’非編碼區(qū)(5’-UTR,5’-untranslatedregion),長93bp的3’非編碼區(qū)(3’-UTR,3’-untranslatedregion)。通過RT-PCR和western-blot對其進行了mRNA水平和蛋白水平的時空表達分析,發(fā)現zfol在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中呈現出動態(tài)變

3、化,在斑馬魚胚胎發(fā)育初期,zfolmRNA表達量較高,隨著胚胎的不斷發(fā)育,zfol的
　　mRNA表達量有所下降,到后期表達量又上升;斑馬魚成魚各組織中mRNA水平,除了精巢不表達外,在成魚肝臟、腎臟、卵巢、腦、心臟中均有表達,且表達量相當。而Zfol蛋白在卵巢中表達量最高,腎臟中也有表達,但是表達量相對較低,而在肝臟、腦、精巢、心臟這些組織中均不表達;在胚胎發(fā)育0到4小時時蛋白的表達量較高,6~9小時蛋白表達量下降,12~16小

4、時蛋白表達量又再上升,20~24小時下降,到36小時蛋白表達量升高,而后Zfol蛋白的表達量又下降。為了進一步研究zfol基因在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中所扮演的角色,我們選擇基因敲除技術來研究zfol的功能,構建zfol基因的斑馬魚突變體,在現有的基因敲除技術中,又以TALENs技術最具優(yōu)勢,能夠對目的基因的特異序列進行誘變,且突變率高,與其他技術相比,優(yōu)勢明顯,故在本研究中我們采用TALENs技術對zfol進行誘變,達到敲除zfol基因的

5、目的。利用TALENs技術,通過設計能夠特異性識別zfol目標序列的TALENs,誘導zfol目標序列產生插入或缺失突變,從而導致蛋白翻譯提前終止,起到敲除zfol基因的作用,構建zfol的突變體。通過對zfol基因的斑馬魚突變體進行研究,初步了解zfol在斑馬魚胚胎生長發(fā)育過程中發(fā)揮的功能。對zfol斑馬魚突變體的生長發(fā)育過程進行觀察發(fā)現,缺失zfol后的斑馬魚發(fā)育較緩慢,同時對其表型進行分析表明,圍心腔處有輕微膨大的現象,這些結果暗