捻轉血矛線蟲感染性三期幼蟲gst和ubq基因的篩選及抗干燥功能分析.pdf

1、捻轉血矛線蟲寄生于綿羊和山羊的皺胃內(nèi)以吸血為生，是引起宿主致病和造成經(jīng)濟損失最嚴重的腸道寄生線蟲種類之一，分布范圍很廣。現(xiàn)階段對捻轉血矛線蟲的防治主要以藥物為主，但蟲體抗藥性的問題日益嚴重。分子疫苗也是近年來研究的熱點，但由于對捻轉血矛線蟲的免疫機理了解不深，至今還沒有成功的疫苗上市。目前防治捻轉血矛線蟲的措施主要集中在寄生階段，對自由生活的幼蟲防控方法較少。捻轉血矛線蟲感染性三期幼蟲對干燥脅迫都有很強的適應性，此時常形成休眠狀態(tài)，相關

2、行為、形態(tài)和生化機制改變以抵抗極端環(huán)境。目前捻轉血矛線蟲L3期幼蟲在干燥脅迫下的生存機制尚不清楚。本實驗通過篩選捻轉血矛線蟲感染性三期幼蟲在干燥環(huán)境下的相關基因，探索其能抵抗外界干燥環(huán)境，成功感染宿主的分子機制，為捻轉血矛線蟲自由生活階段的防控措施提供思路。
　　本研究分別提取正常培養(yǎng)和50％相對濕度條件下干燥培養(yǎng)的捻轉血矛線蟲感染性三期幼蟲mRNA，反轉錄成cDNA。采用銀染mRNA差異基因顯示技術在干燥和正常培養(yǎng)的銀染聚丙烯酰

3、胺凝膠中回收差異顯示條帶，PCR再擴增回收測序，進行生物信息學分析。結果顯示，篩選獲得58個差異表達的EST序列，生物信息學分析表明其中49個(84.48％)序列與現(xiàn)有的捻轉血矛線蟲基因組數(shù)據(jù)庫有高度同源性，18個(31.03％)與已知線蟲的cDNA或基因組序列有較高同源性，11個(18.96％)與其它線蟲已知蛋白質氨基酸序列同源性較高。差異表達序列BF-U01A包含泛素(UBQ)家族結構域，與秀麗隱桿線蟲泛素家族氨基酸同源性高達95％

4、。差異表達序列GH-U02A與已知捻轉血矛線蟲谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)氨基酸同源性為94％。其他差異表達序列分別與各種線蟲的半胱氨酸蛋白酶，轉座酶和與G蛋白偶聯(lián)受體，β轉導蛋白重復和GIY-YIG族核酸內(nèi)切酶等相關的假定蛋白有關。
　　為驗證銀染mRNA差異顯示技術篩選出的差異表達序列，本實驗采用相對熒光定量PCR分析干燥條件下基因表達的調節(jié)趨勢。結果表明，Hc-ubq和Hc-gst基因在干燥蟲體中的表達量較正常蟲體分別上調

5、了2.1倍和2.2倍，基因表達上調極顯著(P＜0.01)。為進一步驗證Hc-ubq和Hc-gst基因對捻轉血矛線蟲三期幼蟲抗干燥功能的影響，在捻轉血矛線蟲中對兩基因進行RNA干擾，再將捻轉血矛線蟲三期幼蟲干燥后再水化復蘇，結果顯示ubq基因RNAi組平均存活數(shù)量為154條，平均生存率為77％，與對照組相比生存率顯著降低(P＜0.05)，gst基因RNAi組平均存活數(shù)量為167條，平均生存率為83.5％，較對照組顯著降低(P＜0.05)。

6、表明Hc-ubq和Hc-gst基因在捻轉血矛線蟲的干燥調節(jié)中有重要作用。
　　同時，為驗證ubq和gst基因對抗干燥的調控在低濕休眠線蟲種類的抗干燥調節(jié)中否重要，對模式生物秀麗隱桿線蟲Ce-gst-7和Ce-ubq-2基因進行RNA干擾。結果顯示，滯育蟲體經(jīng)干燥再水化的過程后，對照組在干燥后再水化復蘇的生存率為86％; gst基因RNAi組生存率為56.5％，較對照組顯著降低(P＜0.05);ubq基因RNAi組干燥后復蘇的生存率

7、為67％，較對照組顯著降低(P＜0.05)。證明gst和ubq基因在線蟲處于干燥狀態(tài)時，對蟲體生存的調控有一定功能。
　　綜上所述，為研究捻轉血矛線蟲感染性三期幼蟲抗干燥的相關分子機制，本實驗通過銀染mRNA差異顯示法篩選出58個差異表達序列，對其中與已知捻轉血矛線蟲谷胱甘肽-S-轉移酶和秀麗隱桿線蟲泛素家族同源性較高的Hc-gst和Hc-ubq序列通過相對熒光定量PCR后結果表明兩基因在干燥蟲體中的表達均上調。在捻轉血矛線蟲中對