捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲免疫蛋白組和比較蛋白組研究.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchus contortus）屬毛圓科(Trichostrongylidae)血矛屬（Haemonchus）線蟲，分布較廣。寄生于反芻動物第四胃和小腸，因吸血可導(dǎo)致宿主貧血和衰弱，引起幼齡動物，尤其是羔羊死亡，對畜牧業(yè)造成極大經(jīng)濟(jì)損失。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病傳統(tǒng)的防治方法是使用化學(xué)驅(qū)蟲藥并結(jié)合牧場管理，但隨著抗藥蟲株的出現(xiàn)和蔓延，以及嚴(yán)重的藥物殘留問題，傳統(tǒng)的化學(xué)防治方法受到了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。這已經(jīng)迫使人們將注意力轉(zhuǎn)移到利

2、用免疫學(xué)方法來防治該病，尤其是疫苗的開發(fā)上。
　　 發(fā)現(xiàn)新的免疫原性蛋白對發(fā)展有效的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲疫苗是十分必要的。本文利用免疫蛋白組學(xué)的方法對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲的可溶性蛋白以及排泄分泌蛋白展開研究，以期找到一些新的疫苗候選抗原或藥靶。為此，我們進(jìn)行了以下工作：
　　 1.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲免疫蛋白組研究
　　 應(yīng)用免疫蛋白組學(xué)的方法分析捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲雌雄蟲的可溶性蛋白，在考馬斯亮藍(lán)G-250染色的2-D凝膠上分別檢

3、測到雄蟲662和雌蟲680個蛋白點，主要集中在pH5-9范圍內(nèi)。雌雄蟲共有的蛋白點是609個。以自然感染的抗捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的山羊血清作為一抗，對雌雄蟲蛋白作westem blot分析，分別檢測到雄蟲193和雌蟲196個免疫原性蛋白點。雌雄蟲共有的免疫原性點是64個。質(zhì)譜分析了23個雌雄蟲共有的免疫原性蛋白點，數(shù)據(jù)庫檢索有結(jié)果的點對應(yīng)的蛋白包括捻轉(zhuǎn)血矛線蟲谷氨酸脫氫酶(GDH)，以及dim-1，肌動蛋白(actin)，珠蛋白樣排泄分泌蛋白F

4、6，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，ATP酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的同系物。除了GDH和GST已經(jīng)報道過，其它的蛋白均為新發(fā)現(xiàn)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的免疫原性蛋白。
　　 2.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲雌雄蟲比較蛋白組研究
　　 應(yīng)用蛋白組學(xué)的方法比較分析捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲雌雄蟲的可溶性蛋白，質(zhì)譜分析了20個雌雄蟲差異蛋白點，這些點包括性別特異的點和豐度上有顯著差異的點。數(shù)據(jù)庫檢索有結(jié)果的蛋白點對應(yīng)的雄蟲特有蛋白有主要精子蛋白msp-49和

5、驅(qū)動蛋白klp-17的同系物；對應(yīng)的雌蟲特有蛋白有琥珀酸脫氫酶黃素蛋白亞基的同系物，熱休克蛋白20，秀麗隱桿線蟲血管內(nèi)皮生長因子受體ver-4和F32A5.2b蛋白的同系物；谷氨酸脫氫酶以及肌動蛋白同系物在雌雄蟲中均表達(dá)，且在雄蟲中的豐度顯著高于雌蟲。以自然感染的抗捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的山羊血清作為一抗，對雌雄蟲蛋白作westem blot分析，發(fā)現(xiàn)谷氨酸脫氫酶、熱休克蛋白20、以及肌動蛋白和驅(qū)動蛋白klp-17同系物能被抗血清識別。
　

6、　 3.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲排泄分泌蛋白組研究
　　 應(yīng)用免疫蛋白組學(xué)的方法分析捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲雌雄蟲排泄分泌蛋白，在考馬斯亮藍(lán)G-250染色的2-D凝膠上分別檢測到雄蟲176個和雌蟲183個蛋白點，雌雄蟲共有的蛋白點是158個。以自然感染的抗捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的山羊血清作為一抗，對雌雄蟲排泄分泌蛋白作western blot分析，分別檢測到雄蟲149和雌蟲156個免疫原性蛋白點，雌雄蟲共有的點是121個。質(zhì)譜分析了20個雌雄蟲共有的免

7、疫原性蛋白點，數(shù)據(jù)庫檢索有結(jié)果的點對應(yīng)了12種蛋白：捻轉(zhuǎn)血矛線蟲24kDa排泄分泌蛋白(ES24)，絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(HcSTK)，P100-GA蛋白，金屬肽酶和谷氨酸脫氫酶(GDH)，以及秀麗隱桿線蟲ZK287.1蛋白和烯醇化酶(enolase)的同系物，新桿狀線蟲CBG13342、CBG07031、CBG03816和CBG24211蛋白的同系物，Procambarus clarkii精氨酸激酶的同系物。其中絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，

8、以及精氨酸激酶和5個Caenorhabditis蛋白的同系物作為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲免疫原性蛋白未曾報道過。4.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲肌動蛋白基因的克隆與原核表達(dá)
　　 根據(jù)GenBank上公布的幾種線蟲的肌動蛋白(actin)基因ORF的序列，設(shè)計簡并引物，以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的總RNA為模板，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出約1，100bp的條帶。基因測序結(jié)果表明，該片段完整ORF為1，131bp，編碼376個氨基酸。經(jīng)BLAST分析表明，其核酸序列與秀

9、麗隱桿線蟲、新桿狀線蟲、腫孔古柏線蟲等同源性達(dá)86％左右；其氨基酸序列與胎生網(wǎng)尾線蟲、秀麗隱桿線蟲、新桿狀線蟲、馬來絲蟲等達(dá)98％左右。重新設(shè)計表達(dá)引物，將該ORF克隆到pET-28a(+)載體中，經(jīng)酶切鑒定正確后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)，以異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。SDS-PAGE表明表達(dá)的融合蛋白約46kDa，以包涵體的形式表達(dá)。以自然感染的抗捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的山羊血清作為一抗，western

10、 blot分析結(jié)果顯示該融合蛋白與抗血清反應(yīng)出現(xiàn)特異性條帶，表明肌動蛋白能夠被宿主的免疫系統(tǒng)識別。將表達(dá)的融合蛋白純化后免疫小鼠，制備抗血清作為一抗，western blot分析結(jié)果顯示在43kDa處出現(xiàn)特異性條帶。
　　 5.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲谷氨酸脫氫酶基因的克隆與原核表達(dá)
　　 根據(jù)GenBank上公布的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase， GDH)基因（登錄號AF000967）的

11、ORF的序列，設(shè)計1對引物，以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的總RNA為模板，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出約1，600bp的產(chǎn)物?；驕y序結(jié)果表明，該片段長度為1，617bp，編碼538個氨基酸。經(jīng)BLAST分析表明，其核酸序列與已經(jīng)公布的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲谷氨酸脫氫酶的ORF同源性為98％；氨基酸序同源性也為98％，表明擴(kuò)增片段為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲谷氨酸脫氫酶的ORF序列。將該片段克隆到pET-28a(+)載體中，經(jīng)酶切鑒定正確后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)