捻轉(zhuǎn)血矛線蟲滯育相關(guān)基因daf-22和hsp70全基因的獲得及其功能的研究.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病是寄生于牛、羊等反芻動物的一種重要的寄生蟲病，因引起感染動物貧血、消瘦甚至死亡而給畜牧業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失。該病是由感染性三期幼蟲感染宿主引起，具有明顯的季節(jié)性。當(dāng)外界環(huán)境進入寒冷的冬季時，幼蟲及蟲卵難以存活，進入滯育階段是捻轉(zhuǎn)血矛線蟲在宿主體內(nèi)越冬的唯一方式，也是春季反芻動物爆發(fā)該病的主要原因。因而控制線蟲的滯育、探明產(chǎn)生該現(xiàn)象的生物化學(xué)和分子生物學(xué)機制很可能是解決該病周期性流行和季節(jié)性爆發(fā)的關(guān)鍵問題。鑒于此，本研究以捻

2、轉(zhuǎn)血矛線蟲為研究對象，以秀麗隱桿線蟲為模式生物，通過mRNA差異顯示技術(shù)獲得捻轉(zhuǎn)血矛線蟲滯育階段表達差異性基因片段，進一步利用RACE技術(shù)和基因步移技術(shù)獲得滯育相關(guān)基因Hc-daf-22基因和Hc-hsp70基因全序列，并采用RNA干擾技術(shù)和拯救技術(shù)確定這些基因?qū)€蟲滯育的影響，研究結(jié)果為闡明寄生性線蟲的滯育機制奠定了良好基礎(chǔ)。
　　 1.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲三期感染性幼蟲培養(yǎng)方法的改進
　　 參考國外已報道的蛇形毛圓線蟲和普通

3、奧斯特他（氏）線蟲蟲體的培養(yǎng)技術(shù)，建立了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲幼蟲的培養(yǎng)方法。收集自然感染羊體內(nèi)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲雌蟲子宮內(nèi)的蟲卵，以含有Earle's液和酵母粉的瓊脂平板為培養(yǎng)基，對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的自由生活階段蟲體進行了體外培養(yǎng)和觀察，并對所獲得的感染性三期幼蟲進行了感染性驗證，結(jié)果表明，該方法能獲得純度較高的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲自由生活各階段蟲體，為感染實驗及開展分子生物學(xué)研究提供基礎(chǔ)。
　　 2.利用mRNA差異顯示技術(shù)獲得捻轉(zhuǎn)血矛線蟲滯育階段幼

4、蟲與正常蟲體差異基因，通過比對進行初步分析
　　 參考Kooyman(1994)發(fā)表的文獻，將蟲體置于15℃盛有自來水的平皿中5周，計數(shù)后，挑取5000條具有活力的蟲體攻入無線蟲感染的羊體內(nèi)，感染后第35天剖殺羊只，剖檢真胃，挑取蟲體，根據(jù)蟲體形態(tài)特征辨別獲得滯育期蟲體。同時以體外培養(yǎng)的四期幼蟲為正常蟲體對照。提取滯育期蟲體和正常蟲體的RNA，分別采用隨機引物和錨定引物對其進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA。將獲得的cDNA進行聚丙烯

5、酰胺凝膠電泳，銀染，回收銀染后的差異條帶，連接至pMD18-T載體，測序，共獲得了74個差異片段。將所獲得的片段分別在NCBI與寄生性線蟲庫中進行比對，結(jié)果顯示，有14個片段與已公布的線蟲序列有同源性，有29個片段與已發(fā)表的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲基因組序列具有較高的同源性。
　　 3.以秀麗隱桿線蟲為模式生物，選取部分同源性基因進行初步功能驗證，篩選差異片段
　　 分析所獲得的差異片段中與已知序列有同源性的片段，選取合適的酶切位點

6、，連接至RNAi專用載體L4440上，鑒定陽性后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌HT115中，重新鑒定。將陽性克隆菌液均勻涂布于含有IPTG的NGM平板中，室溫干燥后，放置過夜。挑取秀麗隱桿線蟲同期蟲體，飼喂構(gòu)建好的重組載體，同時，選取秀麗隱桿線蟲hsf-1基因作為陽性對照，空載L4440為陰性對照。通過觀察RNAi后蟲體表型、產(chǎn)卵量、以及滯育形成能力篩選出差異片段中有滯育功能的片段。實驗結(jié)果顯示:RNAi后，片段A342出現(xiàn)了明顯的表型，飼喂A182

7、與E181片段的秀麗隱桿線蟲的產(chǎn)卵量顯著低于陰性對照組L4440，片段A342、A382及E211對秀麗線蟲的滯育形成起到了明顯的干擾作用。
　　 4.Hc-daf-22基因的獲得，利用秀麗隱桿線蟲進行啟動子及功能研究
　　 以獲得的A382(541bp)為模板，設(shè)計引物，通過5’和3’RACE技術(shù)獲得了該EST的全序列。該基因全長1602bp，編碼533個氨基酸，與秀麗線蟲的daf-22基因具有很高的同源性，故命名為H

8、c-daf22。根據(jù)已獲得的cDNA設(shè)計引物獲得該基因的基因序列6939bp，分析顯示，該基因包含有16個外顯子，15個內(nèi)含子。通過基因步移的方法獲得該基因的5’側(cè)翼區(qū)1548bp，連接至載體pPD95.77，利用顯微注射驗證其啟動子活性，結(jié)果證實該區(qū)域具有啟動子活性，可以啟動GFP在幼蟲及成蟲階段蟲體咽部、分泌細胞、腸道內(nèi)表達。同時擴增秀麗隱桿線蟲daf-22基因上游5’側(cè)翼區(qū)2061bp，連接至載體pPD95.77，將所獲得的載體進

9、行顯微注射驗證其啟動子活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該啟動子能夠高強度的啟動GFP的表達，表達部位為腸道。將所獲得的Hc-daf-22全基因設(shè)計引物，使其包含有該基因的所有功能域，連接至已驗證具有秀麗隱桿線蟲啟動子活性的重組載體上，并顯微注射，觀察熒光，檢驗?zāi)磙D(zhuǎn)血矛線蟲daf-22基因是否可以在秀麗線蟲體內(nèi)表達;結(jié)果顯示:通過熒光檢測，Hc-daf-22基因可以在秀麗隱桿線蟲野生株體內(nèi)大量表達，表達方式與秀麗線蟲啟動子有所不同，表達部位主要集中在腸道，

10、但腸細胞表達更為明顯;將驗證具有活性的重組載體顯微注射入秀麗線蟲daf-22突變株（OK693）內(nèi)，通過Oil-Red-O染色突變株蟲體腸道內(nèi)脂肪，觀察脂肪沉積的多少及顆粒的大小，分析該基因?qū)π沱惥€蟲的拯救情況。基因拯救結(jié)果顯示:通過拯救，突變株脂肪顆粒明顯減少或消失，拯救后的蟲體長度、寬度以及產(chǎn)卵數(shù)比突變株明顯增加，但與野生株相比還有顯著差異，蟲體的發(fā)育階段并沒有顯著變化。該結(jié)果證明捻轉(zhuǎn)血矛線蟲daf-22基因?qū)π沱愲[桿線蟲daf-2

11、2基因突變株進行了部分拯救。
　　 同時，根據(jù)所得基因設(shè)計引物，獲取捻轉(zhuǎn)血矛線蟲daf-22基因包含功能域的845bp，連接至L4440載體，轉(zhuǎn)化HT115，通過飼喂秀麗隱桿線蟲進行RNAi，觀察蟲體脂肪沉積的變化，分析該基因?qū)π沱愲[桿線蟲的干擾效果。研究結(jié)果顯示，飼喂捻轉(zhuǎn)血矛線蟲daf-22基因的蟲體，脂肪沉積明顯增多，且具有比正常株及陰性對照組大的脂肪顆粒，結(jié)果證明，該基因?qū)π沱愲[桿線蟲起到了明顯的干擾作用。
　　

12、5.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲hsp70基因全基因的獲得，利用秀麗隱桿線蟲進行啟動子及表達分析
　　 根據(jù)已獲得的序列A342(709bp)設(shè)計引物獲得部分基因組序列，通過基因步移技術(shù)和長距離反轉(zhuǎn)錄PCR擴增出捻轉(zhuǎn)血矛線蟲熱激蛋白基因hsp70全基因序列3925bp及cDNA序列1941bp，基因分析顯示該基因含有7個外顯子，6個內(nèi)含子，編碼646個氨基酸，包含三個hsp70家族蛋白特征區(qū)，且與其他已知物種的hsp70具有很高的同源性;同時，

13、通過基因步移的方法，本研究還擴增得到該基因上游2239bp的5'flanking區(qū)。通過軟件分析顯示，該區(qū)具有假定的熱激因子結(jié)合位點、TATA box、GAGA結(jié)合位點、CAC結(jié)合位點、CACCC結(jié)合位點、CCAAT box等啟動子重要元件;將該片段連接至pPPD95.77載體，顯微注射至秀麗隱桿線蟲體內(nèi)，通過熒光觀察確定其是否具有啟動子活性，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):該啟動子可以啟動GFP在秀麗隱桿線蟲各個生活階段的腸道內(nèi)表達，熒光表達強度隨著蟲

14、體的發(fā)育不斷增強，且存在兩種表達方式。
　　 將所獲得的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲hsp70基因首先連接至原核表達載體pET28b中，在其C末端加入6×His標(biāo)簽，鑒定正確后，IPTG誘導(dǎo)表達，經(jīng)SDS-PAGE與Western blot分析，研究結(jié)果顯示，二者均可在70KD處檢測到明顯的特異性條帶;以連接好的原核表達載體為模板，重新設(shè)計引物，使得捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的hsp70基因下游帶有6×His標(biāo)簽，將該片段連接至秀麗隱桿線蟲熱激專用載體pPP

15、D49.78和pPD49.83，顯微注射至秀麗隱桿線蟲體內(nèi)，通過His單抗進行Western blot分析:在秀麗隱桿線蟲熱激2，4，6小時后均可檢測到特異性條帶，且條帶大小與原核表達條帶位置一致;同時，本研究還通過熒光定量PCR的方法，檢測了秀麗隱桿線蟲hsp-1基因在顯微注射捻轉(zhuǎn)血矛線蟲hsp70基因后，在mRNA水平上的變化，結(jié)果顯示:顯微注射后，秀麗隱桿線蟲hsp-1基因表達水平熱激后同N2相比顯著下調(diào)。該結(jié)果證明捻轉(zhuǎn)血矛線蟲h

16、sp70基因?qū)π沱愲[桿線蟲hsp-1熱激后的mRNA水平具有顯著影響，這為Hc-hsp70可能具有秀麗隱桿線蟲hsp-1基因相似的功能提供了依據(jù)。
　　 綜上所述，本研究首次獲得了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲滯育期蟲體差異表達基因，通過生物信息學(xué)分析及在秀麗隱桿線蟲中的RNAi試驗篩選出具有明顯表型及對滯育形成相關(guān)功能具有顯著影響的差異基因;通過RACE技術(shù)及基因步移技術(shù)，首次獲得了兩個差異基因Hc-daf-22及Hc-hsp70的全序列;利用