捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc38基因保守結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)及基于RNAi的功能初步研究.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchuscontortus）屬毛圓科（Triehostrongylidae）血矛屬（Haemonchus）線蟲，分布較廣。寄生于反芻動物第四胃和小腸，因吸血可導(dǎo)致宿主貧血和衰弱，引起幼齡動物，尤其是羔羊死亡，對畜收業(yè)造成極大經(jīng)濟(jì)損失。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病傳統(tǒng)的防治方法是使用化學(xué)驅(qū)蟲藥并結(jié)合定期轉(zhuǎn)場管理，但隨著耐藥蟲株的出現(xiàn)和蔓延，以及嚴(yán)重的藥物殘留問題，傳統(tǒng)的化學(xué)防治方法受到了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。這已經(jīng)迫使人們將注意力轉(zhuǎn)移到

2、利用免疫學(xué)方法來防治該病，尤其是疫苗的開發(fā)上。
　　Hc38基因在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲腸上皮微絨毛上呈高豐度表達(dá)，據(jù)推測它的表達(dá)產(chǎn)物是一種重要的功能蛋白。該基因表達(dá)產(chǎn)物的196-512位氨基酸構(gòu)成的保守結(jié)構(gòu)域?qū)儆诠δ芪粗牡鞍准易錺f04910，該家族目前有251條蛋白序列登錄在GeneBank上，它們分屬于194種生物，其中的45種為人類或動物的重大血源性疫病病原或傳播媒介。GeneBank公布了該抗原基因的全序列，然而其功能國內(nèi)外尚無

3、相關(guān)報道。為此，作者開展了以下研究：
　　1.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc38基因保守結(jié)構(gòu)域的克隆、原核表達(dá)與分析
　　參照GenBank中發(fā)布的Hc38基因序列設(shè)計引物，擴增出Hc38基因的保守結(jié)構(gòu)域序列，命名為HcP，將其克隆到表達(dá)載體pET32a中，并將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)免疫親和層析柱純化后用SDS-PAGE和Westernblot進(jìn)行檢測并用弗氏佐劑制成疫苗免疫小鼠，每只小鼠免

4、疫100μg蛋白，每隔10d免疫一次，四免后采血，ELISA檢測血清抗體效價。結(jié)果表明，擴增出的片段大小與預(yù)期一致，與參考序列的相似性達(dá)99.34％，說明HcP基因成功克隆，HcP基因在大腸桿菌中高效表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白分子量約為49.4kd，且純化后的表達(dá)產(chǎn)物能與感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的山羊血清產(chǎn)生單一的免疫印記條帶，具有良好的反應(yīng)原性，純化產(chǎn)物免疫小鼠4次后，血清最高效價達(dá)到了1：51200。本實驗成功地克隆、表達(dá)和純化了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc

5、P基因，并對其表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng)原性進(jìn)行了分析，通過免疫小鼠獲得了效價較高的血清。
　　2.siRNA介導(dǎo)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc38基因沉默條件的優(yōu)化
　　將體外孵育的L3期幼蟲分別在無血清和添加5%血清的生理鹽水、PBS、EBSS（Earle’sBalancedSaltSolution）中浸泡培養(yǎng)72h，根據(jù)L3期幼蟲的生存狀態(tài)確定最佳浸泡條件，然后分別用2.5%和5%的LipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)轉(zhuǎn)染效果

6、確定轉(zhuǎn)染試劑最佳濃度，最后分別用終濃度30nM、60nM、90nM和120nM的siRNA浸泡24h、48h和72h，RealtimePCR檢測干擾效果，確定siRNA最佳濃度。L3期幼蟲在添加5%血清的EBSS中生存狀態(tài)最好，采用終濃度50μg/ml的LipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染可以得到85%的轉(zhuǎn)染效率，而用90nM的siRNA1浸泡72h，干擾效率可以達(dá)到80%以上。本研究對siRNA介導(dǎo)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc38基因

7、沉默條件進(jìn)行了優(yōu)化，采用優(yōu)化的條件成功抑制了Hc38基因的轉(zhuǎn)錄。
　　3.RNAi介導(dǎo)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc38基因功能驗證
　　針對Hc38基因序列設(shè)計并合成特異性dsRNA、siRNA，通過浸泡方式分別將dsRNA、siRNA導(dǎo)入捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染性L3期幼蟲體內(nèi)，通過RNA干擾途徑抑制目的基因的轉(zhuǎn)錄，利用實時熒光定量PCR分析Hc38基因在L3期幼蟲中的抑制效果，用干擾后的蟲體感染綿羊，定期采集羊糞并分離蟲卵，研究排卵數(shù)和蟲