真姬菇農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化Hsp70基因.pdf

1、真姬菇（Hypsizygusmarmoreus）是一種珍稀食用菌，屬于中偏低溫型食用菌。菌絲生長溫度5～30℃，最適20～25℃，超過35℃或低于4℃時菌絲不再生長，在45℃以上無法存活，溫度過高或過低都會對真姬菇的生產(chǎn)造成較大影響。因此，真姬菇新品種（高抗菌株）培育成為真姬菇生產(chǎn)和科研中的一個重要課題。熱激蛋白(heatshockprotein，HSP)是一類在有機體受到高溫等逆境刺激后大量表達的蛋白，是生物對逆境脅迫短期適應(yīng)的必需組

2、成成分，對減輕逆境脅迫引起的傷害有很大的作用。熱激蛋白一旦在體內(nèi)形成，生物體就會盡快地適應(yīng)外界環(huán)境，表現(xiàn)出很強的抗逆性。因此，熱激蛋白基因是育種工作中具有重要實用價值的優(yōu)良基因。
　　 在本實驗室已經(jīng)成功克隆出Hsp70基因（GenBank登錄號為GQ246176，全長共2308bp，開放性閱讀框共2001bp，編碼666個氨基酸）的基礎(chǔ)上，本項研究構(gòu)建了Hsp70基因的真姬菇表達載體PHspHyg;然后將Hsp70基因轉(zhuǎn)入真姬

3、菇基因組中，成功獲得了轉(zhuǎn)Hsp70基因真姬菇菌株，并檢測出Hsp70基因在真姬菇中的高效表達。主要研究成果如下:
　　 1.以質(zhì)粒pROK2為出發(fā)質(zhì)粒，通過PCR擴增出完整的Hsp70基因，并在其兩側(cè)加上KpnⅠ和XbaⅠ酶切位點，回收該片段后，將其插入質(zhì)粒pROK2的多克隆位點處，獲得重組質(zhì)粒PHsp;然后在此基礎(chǔ)上，限制性內(nèi)切酶HindⅢ和NheⅠ雙酶切重組質(zhì)粒PHsp，回收質(zhì)粒大片段，通過PCR將質(zhì)粒pCAMBIA1301

4、中的Hyg表達框完整擴增出來，并在其兩側(cè)加上HindⅢ和NheⅠ酶切位點，回收該片段后，與酶切后質(zhì)粒PHsp的大片段相連接，獲得重組質(zhì)粒PHspHyg。成功構(gòu)建了Hsp70基因的真姬菇表達載體。
　　 2.通過對真姬菇的潮霉素抗性試驗，確定了真姬菇G12的潮霉素致死濃度應(yīng)該在20μg/ml左右，據(jù)此將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的初篩濃度定為20μg/ml，復篩濃度定為25μg/ml。通過Cefotaxime對真姬菇的毒性試驗，結(jié)果表明，Cefo

5、taxime對真姬菇G12的菌絲生長基本沒有影響，從而確定了Cef的最佳抑菌濃度為200μg/ml。
　　 3.本實驗采取農(nóng)桿菌介導的方法將Hsp70基因真姬菇表達載體PHspHyg轉(zhuǎn)入真姬菇G12中，使得Hsp70基因表達框整合到真姬菇的基因組DNA中。通過對潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子的驗證，證明成功獲得了轉(zhuǎn)Hsp70基因真姬菇菌株。
　　 4.通過對已經(jīng)成功獲得的真姬菇轉(zhuǎn)化子菌絲，進行45℃高溫不同時間的熱激處理試驗，結(jié)果表明

6、，真姬菇轉(zhuǎn)化子的菌絲對高溫熱激處理比真姬菇對照組的菌絲有較好的耐熱性;SDS-PAGE電泳檢測高溫熱激處理后的真姬菇轉(zhuǎn)化子的菌絲蛋白，結(jié)果表明真姬菇轉(zhuǎn)化子的蛋白在90KDa的表達量要大于對照組真姬菇，結(jié)果與我們預計的一樣。說明我們構(gòu)建的真姬菇轉(zhuǎn)化子可以提高熱激蛋白的表達量，增強真姬菇對高溫的應(yīng)激性。
　　 本試驗研究結(jié)果對通過分子生物學技術(shù)提高食用菌對高溫的應(yīng)激性提供了良好的思路，對農(nóng)業(yè)栽培食用菌與現(xiàn)代生物學技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用有更好