捻轉(zhuǎn)血矛線蟲磷酸丙糖異構(gòu)酶基因克隆、表達、酶活性分析及重組谷氨酸脫氫酶活性測定.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus)屬毛圓科(Trichostrongylidae)血矛屬(Haemonchus)線蟲,寄生于反芻動物(綿羊、山羊和牛等)第四胃,常因吸血導致宿主貧血和衰弱,引起幼齡動物尤其是羔羊的死亡,對畜牧業(yè)造成了極大的經(jīng)濟損失。該病傳統(tǒng)的防治主要采用化學驅(qū)蟲藥和飼養(yǎng)管理相結(jié)合,但隨著近年來抗藥蟲株的出現(xiàn)和蔓延,傳統(tǒng)的化學防治法已受到了嚴峻的挑戰(zhàn)。研制安全、有效的疫苗是防治該病亟待解決的問題。

2、r>　　 磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)是一種糖酵解酶,在機體內(nèi)參與葡萄糖分解代謝,催化丙糖磷酸異構(gòu)體在二羥丙酮磷酸和D型甘油醛-3-磷酸之間的可逆轉(zhuǎn)換,在糖酵解、糖原異生、脂肪酸生物合成以及磷酸戊糖代謝中都發(fā)揮著重要的作用。本文首次克隆了HcTPI的全長基因并進行了原核表達,并對重組HcTPI蛋白的酶動力學特性進行了研究。
　　 1.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲磷酸丙糖異構(gòu)酶cDNA基因的克隆和序列分析
　　 根據(jù)GenBank中公布的捻

3、轉(zhuǎn)血矛線蟲磷酸丙糖異構(gòu)酶序列表達標簽EST(登錄號為CB015183)設(shè)計基因特異性引物,利用5’-RACE和3’-RACE技術(shù)分別獲得該基因的5’端和3’端未知序列,將這些序列拼接后獲得捻轉(zhuǎn)血矛線蟲TPI基因的全長cDNA序列(986bp),序列分析發(fā)現(xiàn),該基因含有一個744bp的最大開放閱讀框(ORF)、64 bp5’非翻譯區(qū),178bp3’非翻譯區(qū)。根據(jù)此ORF設(shè)計1對特異性引物,以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的總RNA為模板,采用RT-PCR技

4、術(shù),擴增出744bp的產(chǎn)物,與推導出的ORF長度一樣,二者序列同源性為99％。利用DNAstar等軟件,結(jié)合網(wǎng)絡(luò)資源對其進行分析,發(fā)現(xiàn)該基因編碼247個氨基酸,推測蛋白的等電點為8.18,分子質(zhì)量為27.47kDa,且含有磷酸丙糖異構(gòu)酶的活性功能位點序列AYEPVWAIGTG,與許多物種的磷酸丙糖異構(gòu)酶都一定的同源性。
　　 2.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的原核表達及重組酶活性測定
　　 應用DNA重組技術(shù),將TPI

5、的ORF克隆到原核表達載體pET32a(+)中,經(jīng)酶切鑒定正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3),以IPTG誘導表達重組HcTPI蛋白。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,pET32a(+)-HcTPI在大腸桿菌中得到成功表達,重組蛋白分子量在45kDa左右。菌體經(jīng)超聲破碎后的沉淀與上清的SDS-PAGE分析結(jié)果表明,融合蛋白在上清和包涵體中均有表達。以感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲山羊的血清作為第一抗體,兔抗山羊IgG-HRP為第二抗體進行weste

6、rn blot分析,結(jié)果顯示在45kDa處出現(xiàn)特異性條帶。采用與α-磷酸甘油脫氫酶偶聯(lián)法對該重組蛋白進行酶活性測定,結(jié)果表明其最適反應溫度為40℃,pH值為7.5。酶促反應動力學結(jié)果顯示,Km和Vmax分別為0.96mmol/L和0.341 mmol/(L·min)。
　　 3.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲谷氨酸脫氫酶的原核表達及重組酶的活性測定
　　 將表達捻轉(zhuǎn)血矛線蟲谷氨酸脫氫酶(HcGDH)的原核表達質(zhì)粒pET-28a(+)-Hc

7、GDH轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中,用IPTG誘導其表達。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,pET-28a(+)-HcGDH在大腸桿菌中得到成功表達,融合蛋白分子量在63kDa左右。菌體經(jīng)超聲破碎,對沉淀與上清進行SDS-PAGE分析,結(jié)果表明重組蛋白以包涵體的形式存在。用His蛋白純化柱對該包涵體蛋白變性純化后,用梯度尿素對其進行連續(xù)透析復性。對純化復性的蛋白進行谷氨酸脫氫酶活性測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該酶為NAD特異性酶且最適反應溫度和pH分