Gluconobacter thailandicus D-阿拉伯糖醇脫氫酶和木糖醇脫氫酶基因的克隆及協(xié)同表達(dá).pdf

1、木糖醇因其甜度高、熱量低且代謝不受胰島素影響等特性而備受關(guān)注，在食品、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，在國(guó)際市場(chǎng)上供不應(yīng)求。近年來(lái)，隨著綠色發(fā)展和可持續(xù)發(fā)展理念越來(lái)越深入人心，人們的環(huán)保意識(shí)增強(qiáng)，生物法生產(chǎn)木糖醇逐漸成為各國(guó)學(xué)者開(kāi)展研究的重點(diǎn)。D-阿拉伯糖醇脫氫酶（ D-arabitol dehydrogenase, ArDH）和木糖醇脫氫酶（xylitol dehydrogenase, XDH）作為木糖醇生物合成途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶，

2、它們的高效表達(dá)對(duì) D-阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)化生產(chǎn)木糖醇起著至關(guān)重要的作用。因此，構(gòu)建高性能的基因工程菌，對(duì)于木糖醇生產(chǎn)效率的提高以及工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的意義。
　　本論文利用PCR技術(shù)從泰國(guó)葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter thailandicus）中擴(kuò)增出 ArDH的編碼基因 ardh，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET28a-ardh，并在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21(DE3)中得到了高效表達(dá)；ardh的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)S

3、DS-PAGE分析顯示有27kDa特異性蛋白條帶出現(xiàn)，純化蛋白并測(cè)定其酶學(xué)性質(zhì)。當(dāng)以D-木酮糖為底物時(shí)，還原反應(yīng)的最適溫度為30℃，最適pH約為5.0，還原反應(yīng)的比活為11.46U/mg，對(duì)D-木酮糖的Km值為27mmol/L，Vmax為22.3μmol/min/mg；當(dāng)以D-阿拉伯糖醇為底物時(shí)，氧化反應(yīng)最適溫度為30℃，最適pH約為9.0，氧化反應(yīng)的比活為27.72U/mg，對(duì) D-阿拉伯糖醇的Km值為12.5mmol/L，Vmax為

4、52.8μmol/min/mg。
　　同時(shí)，克隆并表達(dá)了來(lái)自G. thailandicus的XDH的編碼基因xdh，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET28a-xdh，并在大腸桿菌（ E. coli） BL21(DE3)中得到了高效表達(dá)。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示重組菌BL21(DE3)-xdh有28kDa特異性蛋白條帶出現(xiàn)。經(jīng)過(guò)金屬鎳親和層析及 Sephacryl S-300凝膠層析純化后，系統(tǒng)地測(cè)定其酶學(xué)性質(zhì)。當(dāng)以D-木酮糖為底物時(shí)，還原反

5、應(yīng)的最適溫度為30℃，最適pH約為5.0，還原反應(yīng)的比活為126.3U/mg，對(duì) D-木酮糖的Km值為11.2mmol/L，Vmax為134.2μmol/min/mg；當(dāng)以木糖醇為底物時(shí)，氧化反應(yīng)最適溫度為35℃，最適pH約為11.0，氧化反應(yīng)的比活為28.6U/mg，對(duì)木糖醇的Km值為78.6mmol/L，Vmax為53.6μmol/min/mg。
　　利用重組質(zhì)粒pET28a-xdh和pET28a-ardh構(gòu)建重組質(zhì)粒pET2

6、8a-xdh-ardh，并轉(zhuǎn)入 E. coli BL21(DE3)，實(shí)現(xiàn)了 xdh和 ardh基因的協(xié)同表達(dá)。對(duì)重組菌BL21(DE3)-xdh-ardh和原始菌G. thailandicus分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)果表明重組菌BL21(DE3)-xdh-ardh的木糖醇產(chǎn)量為23.7 g/L，原始菌G.thailandicus的木糖醇產(chǎn)量為12.9 g/L。重組菌從D-阿拉伯糖醇到木糖醇的轉(zhuǎn)化率為29.6％，相較于原始菌從D-阿拉伯糖