捻轉(zhuǎn)血矛線蟲甘油醛-3-磷酸脫氫酶DNA疫苗的免疫保護作用與烯醇化酶特性的研究.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchus contortus）屬毛圓科（Trichostrongylidae）血矛屬（Haemonchus）線蟲，分布較廣，寄生于反芻動物第四胃，偶見于小腸，因吸血常常導致貧血、消瘦、嚴重時甚至死亡，對畜牧業(yè)造成重大經(jīng)濟損失．目前防治該病方法主要是化學藥物驅(qū)蟲，但由于蟲體抗藥性的產(chǎn)生以及藥物殘留和藥物污染等問題，迫使人們將注意力轉(zhuǎn)移到利用免疫學方法來防治該?。?br>　　 本文進行了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲甘油醛-3-磷

2、酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，HcGAPDH）特性研究及其疫苗免疫保護試驗；同時對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲烯醇化酶（Enolase，HcENO）進行了生物學特性研究，克隆得到捻轉(zhuǎn)血矛線蟲磷酸甘油酸激酶基因序列并對其進行了生物信息學分析，主要工作如下：1．捻轉(zhuǎn)血矛線蟲甘油醛-3-磷酸脫氫酶特性的研究
　　 根據(jù)GenBank上登錄的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲甘油醛3磷酸脫氫酶基因EST序列（登錄號

3、為AW670737，登錄長度為362bp）設計基因特異性引物，分別利用5'RACE和3'RACE獲得該基因5，端未知區(qū)和3，端未知區(qū)，從而拼接得到HcGAPDH基因的全長eDNA，然后將該序列遞交GenBank（登錄號為HM145749）．后經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)：該基因全長1303bp，含有最大開放閱讀框(ORF)為1026bp，5’非翻譯區(qū)(5’-UTR)長90 bp，3啡翻譯區(qū)（3'-UTR）長175bp．根據(jù)此基因的全長cDNA設計l對特異

4、性引物，以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的總RNA為模板，利用RT-PCR技術，擴增出約1000bp的產(chǎn)物，測序結果與推導出的ORF序列一致．BLAST分析后將該片段克隆到pET-28a(+)載體中，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導表達融合蛋白．SDS-PAGE結果分析發(fā)現(xiàn)融合蛋白在上清和包涵體中均有表達，分子量約38kDa．以自然感染的山羊血清作為一抗，Western blot分析結果顯示在38kDa處出現(xiàn)特異性條帶．用HcGAPD

5、H表達蛋白的包涵體免疫大鼠制備高免血清做一抗，Western blot分析HcGAPDH基因在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的天然表達，結果在38kD處有明顯條帶，與推測ORF的蛋白大小無明顯區(qū)別．酶活性測定結果表明該重組蛋白具有一定的甘油醛-3-磷酸脫氫酶催化活性，其最適pH值為8，最適反應溫度為40℃．
　　 2.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲甘油醛-3-酸脫氫酶蟲體組織分布的研究
　　 為了研究捻轉(zhuǎn)血矛線蟲甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyeeralde

6、hyde-3-phosphatedehydrogenase，HcGAPDH)在蟲體中的分布與定位情況，我們應用常規(guī)方法表達已構建好的pET28a-HcGAPDH，GE純化柱純化后，免疫SD大鼠制備抗血清．濃縮型S-P免疫組化3步法檢測HcGAPDH抗原在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲體內(nèi)的分布和表達．結果發(fā)現(xiàn)，HcGAPDH主要定位于小腸微絨毛上皮，在其他部位則鮮見．
　　 3.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲pVAXI-HcGAPDH DNA疫苗的構建與體內(nèi)表達情

7、況的檢測
　　 利用DNA重組技術，構建pVAXl-HcGAPDH DNA疫苗．經(jīng)酶切鑒定后，腿部肌肉免疫小鼠，l周后取肌肉注射部位、非注射部位組織，利用RT-PCR和Western-blot技術分別檢測DNA疫苗的轉(zhuǎn)錄與表達情況．RT-PCR檢測結果顯示，小鼠注射部位肌肉所擴增出的目的條帶大小約為1000bp，非注射部位中未能檢測到目的條帶，從而說明重組質(zhì)粒在注射部位可以成功轉(zhuǎn)錄；Western blot檢測結果發(fā)現(xiàn)，在注射部

8、位檢測到大小為38kD的目的蛋白條帶，而非注射部位未能檢測到目的蛋白的條帶，這些結果都為下一步的動物保護性試驗奠定了基礎．
　　 4.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲pVAXI-HcGAPDH DNA疫苗的免疫保護性試驗
　　 使用DNA疫苗pVAXl-HcGAPDH，對9-10月齡山羊做了免疫保護性試驗．健康山羊15只，隨機分成3組，每組5只．一組免疫100μg pVAXI-HcGAPDH，其他兩組為不攻蟲對照組和攻蟲對照組．在試驗山羊的

9、背部皮下多點注射免疫，兩個對照組用lml PBS代替DNA疫苗，一共免疫兩次，中間間隔2周，第二次免疫14天后，疫苗免疫組和攻蟲對照組山羊口腔接種5000條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲第三期感染性幼蟲．從攻蟲后22至34天，每隔一天收集糞便，蟲卵計數(shù)，攻蟲后35天，屠宰山羊并剖解皺胃，分離雌雄蟲體，進行成蟲計數(shù)，同時，采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法，測定了所有試驗山羊血清特異性IgG滴度、血清以及胃粘膜表面和胃粘膜組織勻漿中特異性IgA濃度

10、．在免疫前、首免后14d、二免后14d、攻蟲后14d和殺羊前對以下指標進行檢測：利用ELISA試劑盒檢測血清細胞因子（IFN-γ、TGF-β、IL-4、IL-22）的濃度變化；利用流式細胞術檢測了所有試驗山羊外周血中CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞和B淋巴細胞的變化；利用全自動電子血細胞分析儀對所有試驗山羊的外周血中嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜中性粒細胞、單核細胞和血紅蛋白進行了檢測，結果顯示，DNA疫苗pVAXI-HcGAPD

11、H免疫山羊后，ELISA檢測結果表明血清IgG在首免后14天達到較高水平，二免后抗體水平進一步升高；血清IgA在免疫后出現(xiàn)較高水平的滴度，同時殺羊后發(fā)現(xiàn)胃粘膜組織勻漿具有較高的滴度，免疫后山羊CD4+T淋巴細胞、B淋巴細胞水平顯著高于不攻蟲對照組，同時細胞因子檢測免疫組K,-4水平上升顯著，IFN-γ、TGF-β、IL-22變化規(guī)律性不明顯．分析試驗山羊血細胞發(fā)現(xiàn)，免疫組和攻蟲對照組山羊嗜酸性粒細胞濃度顯著高于不攻蟲對照組．5000條捻

12、轉(zhuǎn)血矛線蟲三期幼蟲攻擊試驗山羊后，免疫組蟲卵減少率為34.9％，雌蟲、雄蟲和成蟲總數(shù)減少率分別為39.23%，36.03%和37.73%，說明pVAXI-HcGAPDH對抵御山羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的感染具有一定效果．
　　 5.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲烯醇化酶特性的研究
　　 根據(jù)GenBank上登錄的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲烯醇化酶（Enolase）基因EST序列（登錄號為BF422728，登錄長度為482bp）設計基因特異性引物，分別利用5’RA

13、CE和3’RACE獲得該基因5'端未知區(qū)和3’端未知區(qū)，從而拼接得到Enolase基因的全長cDNA．分析發(fā)現(xiàn)：該基因全長1583bp，含有最大開放閱讀框（ORF）為1305bp，5’非翻譯區(qū)(5'-UTR)長62 bp，3'啡翻譯區(qū)(3’-UTR)長216bp．根據(jù)Enolase基因的全長cDNA設計l對特異性引物，以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的總RNA為模板，采用RT-PCR技術，擴增出約1300bp的產(chǎn)物，將該片段克隆到pET-28a(+)載體

14、中，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)進行表達．SDS-PAGE結果分析發(fā)現(xiàn)融合蛋白在上清和包涵體中均有表達，分子量約49kDa．以自然感染的山羊血清作為一抗，Western blot結果顯示在49kDa處出現(xiàn)特異性條帶．HcGAPDH表達蛋白的包涵體免疫大鼠制備高免血清做一抗，用Western blot分析HcGAPDH基因在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的天然表達，結果在49kDa處有明顯條帶，與推測ORF的蛋白大小近似．酶活性測定結果表明該重組

15、蛋白具有一定的烯醇化酶催化活性，其最適pH值為7．
　　 6.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲磷酸甘油酸激酶的生物信息學分析
　　 根據(jù)GenBank上登錄的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲磷酸甘油酸激酶(Phosphoglyccrate kinase,HcPGK)基因EST序列（登錄號為CB192372，登錄長度為584bp）設計基因特異性引物，分別利用5'ACE和3'ACE獲得該基因5'端未知序列和3'端未知序列，從而拼接得到PGK基因的全長cDNA．利用