甘油脫氫酶的理性設(shè)計研究.pdf

1、甘油脫氫酶(Glycerol dehydrogenase，GDH，EC1.1.1.6)是甘油代謝回路的關(guān)鍵酶之一，作用是催化甘油生成二羥基丙酮(Dihydroxyacetone，DHA)。DHA是一種水溶性的簡單酮糖，一般以二聚體形式存在，是有機化學(xué)合成中非常重要的一類中間體。作為重要的化工、生化原料，DHA及其衍生物在精細化工、制藥、食品、化妝品工業(yè)和水質(zhì)凈化等方面潛在廣泛的應(yīng)用前景。
　　GDH隸屬于第Ⅲ金屬依賴型多元醇脫氫酶

2、家族。該家族包括丁醇脫氫酶(butanol dehydrogenase，BDH)、乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)、甲醇脫氫酶(methanol dehydrogenase，MDH)、4-氧代-2-己烯二酸還原酶(maleylacetatereductaseⅠ，MAR)、脫氫奎尼酸合成酶(dehydroquinate synthase，DHQS)等。其催化核心為某一金屬離子以及若干與金屬離子螯合的殘基，催

3、化機理為金屬離子和與其螯合的殘基分別與醇羥基的氧原子與氫離子作用，使羥基中O-H鍵斷裂，釋放質(zhì)子，將羥基氧化為酮基或羰基。
　　本研究利用分子模擬與同源建模手段，對GDH進行了理性設(shè)計改造，并探討分析了相關(guān)設(shè)計對酶活的影響。本研究旨在提高GDH的酶活，以期探索一種有效的改造類似氧化還原酶的方法。所做具體工作如下:
　　一、對GDH進行同源建模，分析其三維結(jié)構(gòu)，找出可能的催化活性位點。參考近年文獻中對相同催化機理氧化還原酶的理

4、性設(shè)計方案，針對活性位點周圍的殘基進行突變，引入堿性殘基，提高活性位點附近的電子云密度，設(shè)計出T1-T120H、T2-A122R、T3-G170H、T4-A172R、T5-A253R、T6-A255K、T7-Y270H、T8-G272R、T9-V275E、T10-K274R等十組突變位點。
　　二、對GDH進行第一輪定點突變，構(gòu)建BL21(DE3)/pET28a-T(n)表達體系。隨后，對突變后的GDH進行表達純化，并測定其酶活水

5、平。第一輪突變中，酶的比活普遍提高，最高達到43 U/mg，約為突變前GDH比活的3倍。
　　三、進行第二輪突變，將多個正突變疊加，構(gòu)建多點突變表達體系。該輪突變中GDH比活較第一輪突變又有所提高。將3個突變疊加后，GDH比活最高達到85 U/mg，約為突變前GDH比活的5.8倍。
　　四、對各突變GDH進行同源建模，并將構(gòu)建的模型提交到PROPKA上，計算出各帶電殘基的pKa值。隨后考察了活性殘基pKa值與比活變化的相關(guān)性