堆型艾美耳球蟲(chóng)乳酸脫氫酶DNA疫苗免疫保護(hù)作用及免疫機(jī)理研究.pdf

1、雞球蟲(chóng)病是由艾美耳屬(Eimeria)球蟲(chóng)寄生于雞腸上皮細(xì)胞內(nèi)所引起的寄生蟲(chóng)病,分布于世界各地,對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害巨大.由于目前的藥物預(yù)防、活疫苗接種等防控措施存在較多問(wèn)題,因此,有必要研究新的防控手段。DNA疫苗可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生長(zhǎng)期的體液免疫和細(xì)胞免疫,預(yù)防包括球蟲(chóng)病在內(nèi)的多種疾病,因此成為疫苗發(fā)展的新方向。已經(jīng)有多種球蟲(chóng)保護(hù)性抗原如EtMICs、SO7、5401、cSZ-1、3-1E等被發(fā)現(xiàn),其保護(hù)效果也已經(jīng)被大量的研究所證實(shí)。研究發(fā)現(xiàn),

2、堆型艾美耳球蟲(chóng)(E.acervulina)乳酸脫氫酶(LDH)是相對(duì)分子質(zhì)量為37 kDa,的蛋白,在球蟲(chóng)發(fā)育的4個(gè)階段(卵囊、子孢子、裂殖體和裂殖子)均有相似水平的表達(dá),可對(duì)E.acervulina的攻擊產(chǎn)生部分保護(hù)力,被認(rèn)為是一種很有潛力的疫苗候選抗原。
　　 本研究利用RT-PCR方法從E.acervulina第一代裂殖體克隆了E.acervlina LDH基因,酶切及PCR鑒定均正確的菌株經(jīng)測(cè)序,結(jié)果顯示,克隆片段含一個(gè)

3、長(zhǎng)993 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF),編碼330個(gè)氨基酸,與GenBank上的E.acervulina LDH基因序列相似性為98％。應(yīng)用DNA重組技術(shù),將LDH基因克隆到原核表達(dá)載體pET28a(+)中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組LDH蛋白.SDS-PAGE電泳顯示,pET28a(+)-LDH在大腸桿菌中得到成功表達(dá),其分子量在41 kDa左右。菌體經(jīng)超聲破碎后的沉淀與上清的SDS-PAGE分析結(jié)果表明,

4、重組蛋白主要以包涵體形式存在。
　　 本研究利用DNA重組技術(shù),分別構(gòu)建pVAX-LDH、pVAX-LDH-IFN-γ和pVAX-LDH—IL-2 DNA疫苗。經(jīng)鑒定正確后,分別用重組質(zhì)粒免疫14日齡雛雞,1周后取肌肉注射部位、非注射部位組織和pVAX1空質(zhì)粒注射部位,用RT-PCR和westernblot檢測(cè)疫苗的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)情況。結(jié)果表明,構(gòu)建的DNA疫苗均能在注射部位肌肉成功轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。
　　 將構(gòu)建的DNA疫苗pV

5、AX-LDH、pVAX-LDH—IFN-γ和 pVAX—LDH—IL-2以及LDH重組蛋白和包涵體經(jīng)腿部肌肉分別于14、21日齡兩次免疫雛雞,并設(shè)立感染非免疫和非感染非免疫對(duì)照組,另設(shè)pVAX1空質(zhì)粒注射組。除非感染非免疫組外,28日齡經(jīng)口接種新鮮的E.acervulina孢子化卵囊,攻蟲(chóng)第6天宰殺全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,計(jì)算存活率、進(jìn)行病變記分、增重、卵裳下降率,通過(guò)計(jì)算綜合抗球蟲(chóng)指數(shù)(ACI)這些生理指標(biāo),評(píng)價(jià)構(gòu)建的疫苗對(duì)雞抗球蟲(chóng)保護(hù)力。結(jié)果

6、表明,所構(gòu)建的重組質(zhì)粒對(duì)感染球蟲(chóng)雞均具有一定的保護(hù)效果,其中以pVAX-LDH-IFN-γ和pVAX-LDH-IL-2重組質(zhì)粒組保護(hù)效果最好.
　　 用構(gòu)建的3種DNA疫苗免疫14日齡雛雞,并設(shè)滅菌水注射和pVAX1空質(zhì)粒對(duì)照組.21日齡以同樣劑量加強(qiáng)免疫一次,二免后第7天,取雞脾臟分離淋巴細(xì)胞.采用MTT法測(cè)定脾臟淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng).繕果發(fā)現(xiàn),DNA疫苗免疫后雞脾臟淋巴細(xì)胞增殖水平均顯著高于滅菌水和pVAX1空質(zhì)粒對(duì)照組.說(shuō)明構(gòu)

7、建的DNA疫苗可以刺激雞體的免疫系統(tǒng)尤其是細(xì)胞免疫反應(yīng).
　　 用構(gòu)建的3種DNA疫苗免疫14日齡雛雞,并設(shè)滅菌水注射和pVAX1空質(zhì)粒對(duì)照組,21日齡以同樣劑量加強(qiáng)免疫一次.分別于首次免疫后第7天和第2次免疫后第7天取雞脾臟和盲腸扁桃體分離淋巴細(xì)胞,用帶有熒光標(biāo)記的CD3+、CD4+、CD8+單克隆抗體進(jìn)行熒光染色,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3+、CD4+/CD3+、CD8+/CD3+的比例.結(jié)果發(fā)現(xiàn),第1次免疫后第7天脾臟和盲腸扁

8、桃體中各組間CD3+T淋巴細(xì)胞水平差異均不顯著(P>0.05),第2次免疫后第7天,DNA疫苗組CD3+水平顯著高于滅菌水和pVAX1空質(zhì)粒組(P<0.05).結(jié)果表明,構(gòu)建的DNA疫苗可以增強(qiáng)雞體T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。
　　 用構(gòu)建的3種DNA疫苗免疫14日齡雛雞,并設(shè)滅菌水注射和pVAX1空質(zhì)粒對(duì)照組,21日齡以同樣劑量加強(qiáng)免疫一次.二免后第7天,取雞脾臟和盲腸扁桃體分離淋巴細(xì)胞。提取淋巴細(xì)胞總 RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,進(jìn)行實(shí)

9、時(shí)熒光定量PCR,檢測(cè)脾臟和盲腸扁桃體中IFN-γ、IL-2.IL-4、TNFSF15、IL-17D和TGF-β4 mRNA水平變化,以GAPDH為內(nèi)參照,采用2-△△CT方法計(jì)算各細(xì)胞因子相對(duì)mRNA表達(dá)量.結(jié)果發(fā)現(xiàn),疫苗免疫后雞脾臟和盲腸扁桃體IFN-γ、IL-2、TNFSF15、IL-17D和TGF-β4mRNA水平顯著升高,表明,本研究構(gòu)建的DNA疫苗可以促進(jìn)雞體內(nèi)細(xì)胞因子分泌.
　　 用構(gòu)建的3種DNA疫苗免疫14日齡

10、雛雞,并設(shè)滅菌水注射和pVAX1空質(zhì)粒對(duì)照組,21日齡以同樣劑量加強(qiáng)免疫一次。1周后心臟采全血,制備血清,之后每間隔1周心臟采血,一直采樣到二免后第6周。用重組LDH蛋白作為包被抗原,采用間接ELISA方法,檢測(cè)血清樣品的IgG水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn):二免后1—6周,疫苗組顯示了顯著高于滅菌水和pVAX1空質(zhì)粒組的特異性LDH抗體水平。pVAX-LDH-IFN-γ組和pVAX—LDH—IL-2組的抗體滴度比pVAX-LDH高,且差異顯著。pVA