雞柔嫩艾美爾球蟲e.tenellamz57基因免疫調(diào)節(jié)型dna疫苗的構(gòu)建及其免疫保護(hù)性試驗(yàn)

1、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文雞柔嫩艾美爾球蟲（E.tenella）MZ5-7基因免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗的構(gòu)建及其免疫保護(hù)性試驗(yàn)姓名：格日勒?qǐng)D申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：李祥瑞20050601格【J 勒例：雞柔嫩艾美爾球蟲( E f P n P ，陸) M z 5 —7 基兇免疫調(diào)節(jié)型D N A 疫苗的構(gòu)建及其免疫保護(hù)性試驗(yàn)誘導(dǎo)后表達(dá)出的融合蛋白大小為3 5 ．3 k D 。利用D N A 重組技術(shù)，將柔嫩艾美爾球蟲( E i

2、m e r i a t e n a l l a ) 第2 代裂殖子抗原基因M Z 5 ．7 完整盼瀆框中不含信號(hào)肽部分基因克隆到真核表達(dá)載體p e D N A 4 ．0 中，構(gòu)建D N A 疫苗載體p c D N A 4 ．0 一M Z 。用同樣方法，將雞成熟白細(xì)胞介素．1 7 、白介素一2基因( 完整閱讀框分別為5 0 7 b p 和4 3 3 b p ) 分別與M Z 5 ．7 基因串連，使M Z 5 ．7 基因位于I L 一1 7

3、 基因和I L ．2 基因的上游，將串連基因克隆到p c D N A 4 ．0 ，構(gòu)建成免疫調(diào)節(jié)型D N A 疫苗載體p e D N A 4 ．0 ．M Z - I L 一1 7 和p c D N A 4 ．0 一M Z - I L ．2 。應(yīng)用3 種D N A 疫苗純化栽體質(zhì)粒，胸部肌肉注射免疫1 周齡雛雞( 5 0 “g ／雞) ，在免疫后第3 d 、5d 、7 d 、1 5d 和2 0 d 取注射和非注射部位肌肉組織，分別用R T

4、 ．P C R 和W e s t e r n b l o t 方法撿測(cè)抗原基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)情況。結(jié)果表明，3 種疫苗免疫后第5 、7 和1 5 d ，R T - P C R 方法在注射部位均可檢測(cè)到M Z 5 ．7 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，大小約9 0 0 b 口，但在第3 d 扣2 0 d未檢測(cè)到。相同時(shí)間用W e s t e r n b l o t 方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在第5 和7 天，免疫雞肌肉組織中檢測(cè)到表達(dá)產(chǎn)物，p c D N A 4 ．

5、0 一M Z 表達(dá)產(chǎn)物大小約3 6 ．5k D ( M Z 為3 2 ．6 k D ，載體上融合的蛋白為3 ．8 9 k D ) ，與理論推測(cè)值一致， p c D N A 4 ．0 ．M Z ．I L 一1 7 和p c D N A 4 ．0 一M Z ．2 表達(dá)產(chǎn)物大小均為6 4 k D 左右，比M Z 5 ．7 和I L ．1 7 基因以及I L ．2 基因之扣的理論推測(cè)值5 7 ．7 3k D ( M Z ．I L 一1 7 為5

6、 3 ．8 4k D ，栽體上融合的蛋白為3 ．8 9 k D )和5 6 ．7 2k D ( M Z ．I L 一2 為5 1 ．2 8k i d ，載體融合蛋白為5 ．4 4 k D ) 略大。但在非注射部位，兩種方法均未檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄或表達(dá)產(chǎn)物。上述結(jié)果表明，通過(guò)肌肉注射，兩種D N A 疫苗均可在雞肌肉組織中進(jìn)行有效表達(dá)。采取D N A 疫苗免疫組和對(duì)照組的雞脾臟( 每組為5 只雞) ，分離出脾臟淋巴細(xì)胞，應(yīng)用半定量R T - P

7、C R 方法檢測(cè)細(xì)胞因子I L ．2 和I F N 叫m R N A 表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明，無(wú)論是免疫組還是對(duì)照組雞的脾臟淋巴細(xì)胞，均能檢測(cè)到不同程度表達(dá)的I L ．2和I F N 吖。但是D N A 疫苗免疫組的表達(dá)量明顯高于未免疫對(duì)照組( P < 0 ．0 1 = 。用已構(gòu)建好的三種D N A 疫苗p c D N A 4 ．0 ．M Z 、p c D N A 4 ．0 ．M Z —I L ．2 和p c D N A 4 ．

8、0 一M Z —I L 一1 7 進(jìn)行免疫保護(hù)試驗(yàn)并進(jìn)行比較。試驗(yàn)共分8 組，分別為：非攻蟲非免疫對(duì)照組、非免疫攻蟲對(duì)照組、p c D N A 4 ．0 - M Z 重組質(zhì)粒組、p e D N A 4 ．0 ．M Z ．I L ．2重組質(zhì)粒組、p c D N A 4 ．0 - M Z - I L 一1 7 重組質(zhì)粒組、M Z P + c h I L ．1 7 重組蛋白、p c D N A 4 ．0 一M Z + c h I L 一1 7

9、 重組蛋白組和p c D N A 4 ．0 空質(zhì)粒組。每組為3 0 只雞，隨機(jī)分組；1 4 目齡首次免疫，2 1 日齡加強(qiáng)免疫一次，免疫途徑為胸部肌肉注射，重組質(zhì)粒劑量為5 0 “∥羽，重組蛋白為1 0 0 “∥羽。2 8 日齡用柔嫩艾美爾球蟲孢子化卵囊攻蟲，攻蟲量為5 ×1 0 4 卵囊／羽。攻蟲后第8 天對(duì)所有的雞稱重，然后剖殺雞取盲腸組織，記錄盲腸病變，進(jìn)行盲腸卵囊記數(shù)，并應(yīng)忍S P S S 統(tǒng)計(jì)軟件分析。結(jié)果表明：3種