五種雞堆型艾美耳球蟲DNA疫苗免疫保護(hù)效果比較.pdf

1、雞球蟲病是一種寄生在細(xì)胞內(nèi)的原蟲疾病，給養(yǎng)禽業(yè)所帶來的經(jīng)濟(jì)損失極為嚴(yán)重。堆型艾美耳球蟲屬于中等毒力的小腸感染的球蟲，其分布很廣各種年齡雞均可感染，感染后產(chǎn)生的免疫力弱，常引起亞臨床型球蟲病。受感染雞群增重受阻和產(chǎn)蛋量下降。這種亞臨床型球蟲病不易引起人們的重視，常引起飼料報酬降低和繼發(fā)感染，該球蟲實際引起的損失，比一般認(rèn)識要大的多，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，應(yīng)用藥物防治遇到了球蟲耐藥性和藥物殘留的問題，大大限制了養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展，球蟲防

2、治需要尋求新的途徑。實踐證明，激發(fā)宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)來防治雞球蟲病是更有效的途徑之一。DNA疫苗的一個顯著優(yōu)勢是刺激機(jī)體產(chǎn)生廣泛的細(xì)胞免疫反應(yīng)和持久的免疫記憶，尤其是聯(lián)合應(yīng)用一些細(xì)胞因子，構(gòu)建調(diào)節(jié)型疫苗，更有誘人的應(yīng)用前景。為此我們選擇堆型艾美耳球蟲3-1E抗原基因分別與雞細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-17、IL-18基因，通過DNA重組技術(shù)串聯(lián)為一體，插入到相關(guān)真核表達(dá)載體當(dāng)中，分別構(gòu)建了pVAX1.0-3-1E、pVAX1.0-

3、3-1E-IFN-γ、pVAX1.0-3-1E-IL-2、pVAX1.0-3-1E-IL-17、pVAX1.0-3-1E-IL-18五種DNA疫苗，進(jìn)行動物免疫保護(hù)性試驗比較這些DNA疫苗的免疫保護(hù)效果。實驗具體分為以下幾個部分： 1.堆型艾美耳球蟲3-1E基因的克隆、鑒定及序列分析 根據(jù)已發(fā)表的Eacervulina3-1E基因序列，利用電腦軟件設(shè)計一對引物，從E。acervulina孢子化卵囊中提取總RNA，然后應(yīng)用

4、RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出E.acervulina3-1E基因并與PMD18-T載體連接，對其進(jìn)行酶切鑒定、PCR鑒定和序列分析。結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為528bp，與GenBank上登錄的E.acervulina3-1E比較，其核苷酸序列同源性為99％。 2.堆型艾美耳球蟲3-1E基因的原核表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物純化 將E.acervulina3-1E基因克隆至原核表達(dá)載體PET-28(a)中并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.Coli BL21

5、，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。SDS-PAGE電泳顯示，表達(dá)的融合蛋白的分子量22kD左右，且在誘導(dǎo)表達(dá)6小時表達(dá)量最多。細(xì)菌經(jīng)超聲波裂解破碎，TritonX-100洗滌，得到的包涵體被純化，SDS-PAGE電泳顯示，PET-28(a)-3-1E表達(dá)的重組蛋白大部分存在于上清中，包涵體中含量很少。 3.DNA疫苗的構(gòu)建 利用重組DNA技術(shù)，構(gòu)建了pVAX1.0-3-1E、pVAX1.0-3-1E-IFN-γ、pVAX1

6、.0-3-1E-IL-2、pVAX1.0-3-1E-IL-17和pVAX1.0-3-1E-IL-18疫苗，酶切鑒定正確后，將重組質(zhì)粒按100ug/羽雞分別接種14日齡雛雞，7天后取注射部位肌肉、非注射部位肌肉，用RT-PCR和Western-blot檢測保護(hù)性抗原的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)情況。結(jié)果表明3-1E、IFN-γ、IL-2、IL-17、IL-18基因均能在注射部位轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，但在非注射部位均未檢測到轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄或表達(dá)產(chǎn)物。 4.堆型艾美耳

7、球蟲DNA疫苗免疫保護(hù)性實驗 實驗動物分為pVAX1.0-3-1E組、pVAX1.0-3-1E-IFN-γ組、pVAX1.0-3-IE-IL-2組、pVAX1.0-3-1E-IL-17組、pVAX1.0-3-1E-IL-18組、非感染非免疫組、感染非免疫組以及3-IE蛋白組。每組30只實驗雞。制備好的基因疫苗和蛋白疫苗經(jīng)肌肉1日齡、21日齡兩次注射雛雞，28日齡經(jīng)口接種新鮮的堆型艾美耳球蟲孢子化卵囊。34日齡撲殺，分別作十二指腸

8、病變記分、OPG值、增重、抗球蟲指數(shù)(ACI)幾個指標(biāo)測定，確定其保護(hù)力的大小。 結(jié)果表明，帶有ChIFN-γ和IL-2的E.acervulina免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗保護(hù)效果比相對應(yīng)的DNA疫苗和蛋白疫苗好。構(gòu)建的E.acervulina免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗的保護(hù)效果以pVAX1.0-3-1E-IFN-γ和pVAX1.0-3-1E-IL-2最好，其增重最大，十二指腸病變記分和OPG值最小，ACI分別為180.36，180.04；