雞堆型艾美耳球蟲(chóng)Hsp90增強(qiáng)型核酸疫苗免疫保護(hù)研究.pdf

1、雞球蟲(chóng)病(Coccidiosis)是由艾美耳科，艾美耳屬（Eimeria）的一種或幾種雞艾美耳球蟲(chóng)引起的以腸道感染為主的細(xì)胞內(nèi)原蟲(chóng)病，雞球蟲(chóng)寄生于各段腸道引起發(fā)病，導(dǎo)致腹瀉、便血和體重降低，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)雞球蟲(chóng)病的防治主要以藥物為主，但由于容易出現(xiàn)耐藥性及藥物殘留，使得一些藥物難以發(fā)揮其有效的作用。目前，安全而有效的基因工程疫苗用于雞球蟲(chóng)病的防治已成為研究熱點(diǎn)?；蚬こ桃呙绾蜻x基因的選擇至關(guān)重要,Hsp90家族是分子

2、大小質(zhì)量81～99 Ku的一種進(jìn)化保守的蛋白質(zhì)，在分子伴侶功能、細(xì)胞循環(huán)調(diào)控、抗原傳遞方面發(fā)揮著重要作用，已有研究表明其與多種寄生蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程關(guān)系密切。
　　本研究根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的堆型艾美耳球蟲(chóng)（E.acervulina）Hsp90基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，通過(guò)RT-PCR方法從E.acervulina子孢子中成功克隆得到大小為2433 bp的Hsp90基因序列，其中包含一段大小為2139 bp的開(kāi)放性閱讀框，編碼713個(gè)氨基酸

3、殘基，蛋白分子質(zhì)量大小為82.5 Ku，將ORF通過(guò)多克隆位點(diǎn)插入pET-30a(+)空載體中，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-Hsp90，轉(zhuǎn)化入E.coli Rosetta感受態(tài)細(xì)胞并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，通過(guò)SDS-PAGE及His單抗Western-blot檢測(cè)，結(jié)果顯示一個(gè)大小為89 Ku的可溶性融合蛋白得以高效表達(dá)。以純化的Hsp90蛋白免疫新西蘭大白兔制各兔抗Hsp90多克隆抗體，間接ELISA和Western-blot檢測(cè)表

4、明其反應(yīng)性和特異性良好。
　　通過(guò)利用一段抗原性小的柔性片段(G4S)3多肽linker，將Hsp90與ChIL-18基因連接后構(gòu)建pVAX-Hsp90及pVAX-IL18-Hsp90重組真核表達(dá)質(zhì)粒，體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞進(jìn)行IFA檢測(cè)，結(jié)果顯示Hsp90及IL-18均可在體外成功表達(dá)，可較好的發(fā)揮其免疫原性并用于后續(xù)動(dòng)物免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)雞分為5組，分別為未免疫未攻蟲(chóng)組（N組）、PBS注射攻蟲(chóng)組(P組)、pVAX1質(zhì)粒注射

5、組（E組）、pVAX-Hsp90質(zhì)粒免疫組（H組）、pVAX-IL18-Hsp90質(zhì)粒免疫組（I組）。實(shí)驗(yàn)組分別以100μL/雞的PBS或100μg/雞的pVAX1、pVAX-Hsp90或pVAX-IL18-Hsp90劑量于14d和21d胸部肌肉注射免疫雛雞，在二次免疫后每只雞口服接種1×105個(gè)孢子化卵囊。檢測(cè)不同處理組雛雞淋巴細(xì)胞增殖功能變化、血清抗體IgG變化、增重情況、十二指腸病變計(jì)分、OPG及抗球蟲(chóng)指數(shù)等各項(xiàng)指標(biāo)，用以評(píng)價(jià)真核

6、表達(dá)質(zhì)粒的免疫保護(hù)效果，結(jié)果表明兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于對(duì)照組，且Ⅰ組數(shù)值均高于H組;H組與Ⅰ組的淋巴細(xì)胞增殖活性在免疫后顯著升高;ELISA方法檢測(cè)血清抗體IgG顯示，H組與Ⅰ組抗Hsp90血清抗體效價(jià)兩次免疫持續(xù)升高，且在35日齡時(shí)達(dá)到最高值，而對(duì)照組未見(jiàn)升高;H組與Ⅰ組綜合抗球蟲(chóng)指數(shù)值分別為166.17和175.32，均可產(chǎn)生有效的抗球蟲(chóng)保護(hù)，這表明Hsp90是一種潛在的球蟲(chóng)保護(hù)性抗原，且ChIL-18對(duì)其免疫效果起到佐劑樣的作用