膠體金免疫層析和實(shí)時(shí)熒光PCR在分枝桿菌快速檢測(cè)與鑒定中的應(yīng)用研究.pdf

1、南方醫(yī)科大學(xué)2011級(jí)博士學(xué)位論文膠體金免疫層析和實(shí)時(shí)熒光PCR在分枝桿菌快速檢測(cè)與鑒定中的應(yīng)用研究RapiddetectionandidentificationofmycobacteriabycolloidalgoldbasedimmunochromatographicassayandrealtimefluorescentPCR課題來源：自籌經(jīng)費(fèi)學(xué)位申請(qǐng)導(dǎo)師姓專業(yè)名培養(yǎng)類培養(yǎng)層所在學(xué)人尹小毛名王前教授稱臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)型學(xué)術(shù)型次博士研究

2、生院南方醫(yī)院答辯委員會(huì)主席答辯委員會(huì)委員高天明吳曉蔓李林溫旺榮鄭衛(wèi)東裘字容鄭磊教授教授教授教授主任技師教授教授2014年5月19日廣州摘要高；DNA指紋方法需要酶切分析，也存在操作繁瑣和成本較高的缺點(diǎn)；測(cè)序法是分子鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于需要特殊的設(shè)備和很高的技術(shù)要求，一般難以在臨床實(shí)驗(yàn)室開展。上世紀(jì)末研究人員應(yīng)用膠體金標(biāo)記的抗MPT64單克隆抗體開發(fā)了一種用于MPT64檢測(cè)的膠體金免疫層析試劑盒，并將其用于分枝桿菌培養(yǎng)物的檢測(cè)，可達(dá)到快速

3、鑒別MTC與NTM的目的。近年來新建立的一種基于rpoB基因擴(kuò)增的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR方法，因不需要使用探針進(jìn)行雜交而具備了成本低廉的優(yōu)勢(shì)，加上實(shí)時(shí)PCR快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，該方法也具備代替?zhèn)鹘y(tǒng)生化方法用于常規(guī)臨床檢測(cè)的潛力。那么上述兩種分枝桿菌快速鑒別方法究竟哪種性能更好還是各具優(yōu)勢(shì)如果各具優(yōu)勢(shì)，我們應(yīng)如何在臨床實(shí)驗(yàn)室工作中對(duì)它們進(jìn)行取舍，取舍的依據(jù)以及每種取舍所帶來的結(jié)果又是什么，而第一部分研究所要解決的正是這些問題。不同DNA雙鏈由于其

4、序列長度和序列組成不同，產(chǎn)生的熔解曲線特征也不同，因而可通過熔解曲線分析進(jìn)行區(qū)分。高分辨熔解曲線分析(Highresolutionmeltingci／rveanalysis，HRMA)是在普通熔解曲線分析的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種高度靈敏的DNA鏈分析方法，能檢測(cè)到DNA鏈中單個(gè)堿基的替換。既然上述的雙重實(shí)時(shí)PCR可通過產(chǎn)物的熔解曲線分析來快速鑒別MrC和NTM，那么是否可以在此基礎(chǔ)上通過結(jié)合HRMA來進(jìn)一步將NTM鑒定到種呢rpoB基因在

5、分枝桿菌中是單拷貝基因，而且各種分枝桿菌的rpoB基因也存在序列差異，理論上應(yīng)用它來鑒定NTM可獲得比多拷貝基因更好的效果，故第二部分內(nèi)容主要是應(yīng)用單重實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)合HRMA來快速鑒定NTM并評(píng)價(jià)其準(zhǔn)確性。分枝桿菌的鑒別和鑒定主要以培養(yǎng)物作為檢測(cè)對(duì)象，而分枝桿菌的培養(yǎng)常需數(shù)周時(shí)間，如果能直接檢測(cè)痰液等臨床標(biāo)本中的分枝桿菌，那么將大大縮短診斷和治療的周期。結(jié)核病的發(fā)病率和患病率遠(yuǎn)高于非結(jié)核分枝桿菌病，故檢測(cè)臨床標(biāo)本中的MTC意義更大，