菊花RNAi載體構(gòu)建與青蒿遺傳再生體系的建立.pdf

1、菊花是多年生宿根草本植物，因其品種、花色和花型眾多，具有很高的觀賞價值，而備受大眾喜愛和研究者的青睞。青蒿是一年生草本植物，常作為菊花嫁接的優(yōu)良砧木。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的一種重要的修飾方式，在植物中普遍存在且發(fā)揮著重要的作用。RNAi是關(guān)閉特定基因的新技術(shù)，在植物功能基因組、植物育種、植物抗逆方面得到廣泛應(yīng)用。本研究以DNA甲基化修飾能影響植物的形態(tài)特征以及RNAi信號能夠通過砧木傳遞作為研究基礎(chǔ)。構(gòu)建能夠影響菊花但不影響青蒿ME

2、T1基因的RNAi載體，同時建立青蒿的遺傳再生體系，為后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴以菊花紫精靈為實驗材料，克隆得到含有不同酶切位點、大小為273 bp的片段，經(jīng)測序分析，同源性為97％。確定該序列即為紫精靈MET1基因的一部分。⑵將靶基因片段通過酶切-連接法，正反向插入載體DHpart27RNAiFADP1P4上，經(jīng)特異性引物PCR擴增驗證、酶切和測序，證實菊花MET1基因序列在載體構(gòu)建中未發(fā)生突變，RN

3、Ai載體構(gòu)建成功。通過凍融法成功將RNAi載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中。⑶取自種青蒿生長40天的幼嫩的葉片、葉柄為外植體，建立了葉片和葉柄的遺傳再生體系。葉片和葉柄最佳的消毒效果分別是：0.1%的升汞中浸泡8 mim和0.1%的升汞中浸泡10mim。葉片和葉柄存活率分別達到92.1%和84.5%；實驗結(jié)果表明，葉片和葉柄均在培養(yǎng)基配方為：MS+2.0 mg/L6-BA+0.5 mg/L2,4-D+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉的固體培養(yǎng)基上愈

4、傷誘導(dǎo)最好，并且葉柄誘導(dǎo)率達到95.7%,遠高于葉片的誘導(dǎo)率（78%）；葉片在培養(yǎng)基MS+1.0 mg/L6-BA+0.05 mg/LNAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉的固體培養(yǎng)基上分化率最高達到95.3%。葉柄在培養(yǎng)基MS+2.0 mg/L6-BA+0.5 mg/L2,4-D+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉的固體培養(yǎng)基上能一次成苗，成苗率為11%；將分化出的青蒿幼苗在1/2MS+1.0 mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉的培養(yǎng)基上生根