桑樹高頻再生體系建立與遺傳轉(zhuǎn)化體系研究.pdf

1、桑樹(Morus alba Linn．)屬多年生雙子葉木本植物，其葉片是家蠶(BombyxmoriL．)的主要天然飼料，人們以獲取桑葉為主要栽培目的。同時，桑樹也是我國傳統(tǒng)的藥用植物。因此，桑樹是我國重要的經(jīng)濟樹種，也是蠶絲業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要物質(zhì)基礎。 木本植物的遺傳轉(zhuǎn)化遠遠落后于大田作物和其他草本植物，其中一個重要原因是木本植物組織培養(yǎng)和植株再生的難度較大，缺乏合適的轉(zhuǎn)化受體材料，難以建立高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，其次是基因型依

2、賴性較強，轉(zhuǎn)化效率不高。在前人工作的基礎上，本研究以農(nóng)桑14號(簡稱農(nóng)14)、育71-1、陜305和大10四個桑品種冬芽為材料，建立了桑樹高效再生體系并對其遺傳轉(zhuǎn)化條件進行了優(yōu)化，通過將β-葡聚糖苷酶(GUS)基因轉(zhuǎn)入桑樹對該體系進行了檢測，為桑樹的遺傳轉(zhuǎn)化提供參考。主要研究結果如下。 1本文探討了植物激素6-BA、NAA、2,4-D、瓊脂、稀土元素鑭以及桑品種對桑樹冬芽分化的影響，篩選出了適于桑樹冬芽分化的最佳培養(yǎng)基為MS+6

3、-BA 1.2 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L+LaCl<,3> 40 mg/L，不同桑品種對桑冬芽分化無顯著性影響。 2采用正交試驗設計，對影響桑樹離體葉片再生的因素：植物激素TDZ、NAA、6-BA、IAA及桑品種、苗齡、葉位等進行了研究，獲得了葉片愈傷組織誘導最佳培養(yǎng)基為：MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L；不定芽分化培養(yǎng)基：MS+6-BA 3.0 mg/L+IAA0.1 mg/L，以選用苗齡為

4、15 d的陜305試管苗葉片，其愈傷誘導率最高達93.9％，不定芽分化率為98.33％，由此建立了桑樹高頻再生體系。 對TDZ作用機理初步探討結果表明，TDZ可抑制葉片的脂質(zhì)過氧化作用，保護細胞膜結構的完整性，阻止葉片葉綠素的降解，抑制POD的活性，延緩離體葉片的衰老，提高了桑樹離體葉片的再生效率。 3本試驗在上述建立的桑樹高頻再生體系基礎上，通過石蠟切片觀察了葉片愈傷再生來源。結果表明：愈傷組織的表皮由一層排列整齊、形

5、狀較小的細胞組成。皮層由大小不等的薄壁細胞組成，排列很不整齊，不定芽發(fā)生是從愈傷組織表皮和表皮下的細胞分生組織化發(fā)育而成，它是由表皮和表皮下一團細胞核較大的小細胞組成，表明桑樹葉片愈傷組織誘導的不定芽有被轉(zhuǎn)化的可能。 4 由于桑樹屬于木本植物，其遺傳轉(zhuǎn)化存在一定難度和特殊性。通過對影響轉(zhuǎn)化效果的因子：菌液濃度(OD<,600>)、菌液浸染時間、共培養(yǎng)時間、選擇培養(yǎng)基中Kan選擇壓和Cef抑菌濃度等進行了優(yōu)化，結果表明當菌液OD600值為