莖瘤芥高效再生體系與遺傳轉(zhuǎn)化體系研究.pdf

1、藥用植物組織培養(yǎng)(medicinal plant tissue culture)不僅是基因工程應(yīng)用于植物資源開發(fā)與利用方面的重要技術(shù)基礎(chǔ)，而且在藥用植物的資源保護(hù)和可持續(xù)利用方面具有重要的作用。本文主要研究具有廣泛食用與藥用價(jià)值的十字花科蕓薹屬芥菜類植物莖瘤芥(Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee)組織培養(yǎng)基的優(yōu)化，花期相關(guān)基因cry2的克隆分析、載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化體系建立。
　　組織培養(yǎng)基

2、的優(yōu)化:以莖瘤芥種子為實(shí)驗(yàn)原材料，采用無菌組培法，種子在1/2MS培養(yǎng)基中生長6天后得到無菌苗，取其子葉作為外植體，應(yīng)用正交試驗(yàn)法研究不同濃度生長激素6-BA、NAA、2.4-D對外植體分化，愈傷組織成苗率的影響。研究結(jié)果顯示最適合莖瘤芥外植體分化成苗的培養(yǎng)基為MS加6-BA3mg/L、NAA0.10mg/L、2.4-D0mg/L，其中1/2MS加0.10mg/L NAA適用于后期組培苗生根，優(yōu)選培養(yǎng)基的再生頻率具有較大的提高。

3、　　花期相關(guān)基因cry2的克隆與載體構(gòu)建:隱花色素cry2（cryptochrome2）是調(diào)控花期的重要基因，在植物體中控制花青素生長與調(diào)控營養(yǎng)均衡;介導(dǎo)子葉下胚軸生長與幼苗去黃化作用;維持內(nèi)源節(jié)律。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)莖瘤芥親緣性植物同源性比較，設(shè)計(jì)出cry2基因擴(kuò)增引物，成功克隆莖瘤芥cry2基因，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建出此基因的超表達(dá)載體、RNAi載體，并成功轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌GV3101，獲得工程菌株。
　　遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立:以含cry2基因

4、RNAi載體的農(nóng)桿菌菌株GV3101為轉(zhuǎn)化材料，應(yīng)用正交試驗(yàn)法研究莖瘤芥遺傳轉(zhuǎn)化過程中不同的預(yù)培養(yǎng)時間、共培養(yǎng)時間、侵染液濃度、侵染時間組合，Kan選擇壓對轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果顯示最適合莖瘤芥cry2基因RNAi載體遺傳轉(zhuǎn)化的條件為預(yù)培養(yǎng)2d、共培養(yǎng)4d、侵染液濃度0D600=0.5，侵染10min、Kan選擇壓為30mg/L。
　　通過對具有廣泛應(yīng)用價(jià)值的莖瘤芥(Brassica juncea var.tumida Tsen et