油菜安全高效轉(zhuǎn)化體系研究.pdf

1、隨著分子生物學(xué)和生物技術(shù)的飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，僅成功應(yīng)用于植物的轉(zhuǎn)化方法就不下10種，如何高效地獲得單拷貝、無(wú)選擇標(biāo)記、穩(wěn)定可育的轉(zhuǎn)基因植株成為植物遺傳轉(zhuǎn)化發(fā)展的方向。油菜是最早從基因工程中獲益的物種之一，自1986年第一例轉(zhuǎn)基因油菜誕生至今，油菜遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)發(fā)展迅速，其中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法以易操作、低費(fèi)用、插入片段明確、拷貝數(shù)低等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)成為首選。但傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法主要依賴(lài)受體細(xì)胞的脫分化和再分化過(guò)程獲得轉(zhuǎn)基因植株，存

2、在基因型依賴(lài)性強(qiáng)、操作繁瑣、影響因素眾多、轉(zhuǎn)化效率低、轉(zhuǎn)化周期長(zhǎng)、易發(fā)生體細(xì)胞變異和出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因沉默等缺陷，不依賴(lài)受體細(xì)胞的脫分化再分化過(guò)程、不或很少依賴(lài)組織培養(yǎng)的整株轉(zhuǎn)化技術(shù)的出現(xiàn)為解決這一矛盾提供了契機(jī)。 鑒于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的共培轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化周期過(guò)長(zhǎng)、影響因素眾多等問(wèn)題，本研究構(gòu)建了含GFP和GUS(插有一擬南芥基因內(nèi)含子)等易于瞬間表達(dá)分析的植物表達(dá)載體。利用這些載體對(duì)影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)油菜遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素對(duì)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，建立了

3、油菜子葉柄和和下胚軸等外植體的高效瞬間表達(dá)體系。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)影響子葉柄和和下胚軸再生、褐化等的因素進(jìn)行優(yōu)化，最終使穩(wěn)定轉(zhuǎn)化效率提高到5％以上，成功獲得了pBILBar-iGUS、pBINPTII-iGUS、pBILBar-GFP、pNapin-fae1RNAi(500，800，1500)、pFae1-fae1RNAi(500，800，1500)等9個(gè)載體的轉(zhuǎn)基因植株。 考慮到不同物種、同一物種的不同品種或生態(tài)型對(duì)農(nóng)桿菌的敏

4、感性不同，本研究從擬南芥中克隆了影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的植物因子VIP1和H2A1的全基因序列，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，以期通過(guò)向油菜等植物導(dǎo)入這些植物因子，探討其在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中的作用和探索提高植物遺傳轉(zhuǎn)化效率的新途徑。 與此同時(shí)，通過(guò)借鑒擬南芥等物種中成熟的整株轉(zhuǎn)化體系，本研究在油菜上對(duì)花粉管通道法、花粉介導(dǎo)法、花序浸染法、花序噴霧法等進(jìn)行了一系列摸索。其中，用花粉管通道法、花粉介導(dǎo)法、花序浸染法成功獲得了轉(zhuǎn)基因油