花生高效遺傳轉(zhuǎn)化體系建立與高蛋白轉(zhuǎn)化體T-DNA整合位點(diǎn)側(cè)翼序列分析.pdf

1、利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的花生丙酮酸羧化酶(PEPC)基因和脂肪酸脫氫酶（FAD2B）基因的RNAi植物表達(dá)載體，采用自創(chuàng)的植株注射法轉(zhuǎn)化花生品種花育22號。運(yùn)用近紅外掃描技術(shù)分析籽粒脂肪酸、含油量和蛋白質(zhì)含量，通過PCR、RT-PCR、ELISA技術(shù)對轉(zhuǎn)化體進(jìn)行鑒定。獲得了蛋白質(zhì)含量明顯提高的花生轉(zhuǎn)化體，對其T-DNA整合為點(diǎn)側(cè)翼序列進(jìn)行了克隆、分析。這是花生上應(yīng)用T-DNA標(biāo)簽法的首次嘗試。主要研究結(jié)果如下:
　　 1、采用選擇標(biāo)記

2、基因NTPⅡ特異引物PCR進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測，預(yù)期擴(kuò)增片段長度為259bp。結(jié)果表明，在PCR檢測的820粒花生種子中，用NTPⅡ特異性引物擴(kuò)增出預(yù)期大小片段的有371粒，證實(shí)轉(zhuǎn)化率為45.24％。隨機(jī)選取了14個(gè)PCR檢測呈陽性種子的PCR產(chǎn)物直接測序。測序結(jié)果經(jīng)與已知序列比對證實(shí)全部是NTPⅡ基因的部分片段，說明目的基因已經(jīng)整合進(jìn)花生基因組中。
　　 2、將測序的花生種子在光照培養(yǎng)箱中于28℃發(fā)芽。選取10粒種子進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，種

3、子經(jīng)嚴(yán)格消毒，種在滅菌的土中，最終成活8株，出苗后提取花生葉片RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR檢測，均擴(kuò)增出預(yù)期長度的條帶。序列分析表明該片段為NPTⅡ，證明該基因已整合入花生基因組中，并且可以正常轉(zhuǎn)錄成mRNA。
　　 3、在上述基礎(chǔ)上又進(jìn)一步做了NTPⅡELISA驗(yàn)證。肉眼可見，樣品孔有明顯的顏色變化，陰性對照和空白對照則沒有變化。使用伯樂酶標(biāo)儀測得相應(yīng)數(shù)據(jù)，說明樣品孔中有NTPⅡ基因表達(dá)產(chǎn)物。ELISA結(jié)果證明，NPTⅡ已整合入花