黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化及T-DNA插入突變體創(chuàng)制.pdf

1、黃瓜(Cucumis sativus L.)是首個(gè)完成基因組測(cè)序的園藝作物，這使得黃瓜功能基因組學(xué)研究成為重點(diǎn)。功能基因組學(xué)研究最直接有效地方法之一是構(gòu)建基因突變體庫(kù)，通過研究突變體來(lái)分離基因、鑒定基因功能。插入突變是植物突變體庫(kù)構(gòu)建的重要手段，隨著農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的日益成熟和T-DNA插入位點(diǎn)鑒定方法的豐富完善，T-DNA插入已經(jīng)成功用于多種植物插入突變體庫(kù)構(gòu)建的研究中。創(chuàng)制黃瓜T-DNA插入突變體對(duì)于研究黃瓜基因功能具有重要

2、意義，也為葫蘆科其他作物功能基因組學(xué)研究提供有力參考。
　　T-DNA插入是在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)的，而黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化主要采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。因此，建立高效穩(wěn)定的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系是創(chuàng)制黃瓜T-DNA插入突變體的前提條件。影響黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素有基因型、外植體類型、培養(yǎng)基成分、菌株及載體類型、茵液濃度、侵染時(shí)間、預(yù)培養(yǎng)及共培養(yǎng)時(shí)間和篩選壓力等，其中培養(yǎng)基成分主要包括:無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、固化劑和其他添

3、加劑等。目前，黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化效率還較低。研究人員從生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、培養(yǎng)條件和篩選壓力等方面對(duì)黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化開展了大量的研究，但在固化劑、抗氧化劑和有機(jī)添加物等方面研究較少。本研究從培養(yǎng)基成分入手，通過改變培養(yǎng)基固化劑、添加抗氧化劑和有機(jī)添加物的方式，對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化，提高了遺傳轉(zhuǎn)化效率。在此基礎(chǔ)上，以植物突變體構(gòu)建常用表達(dá)載體pROK2為T-DNA插入突變載體轉(zhuǎn)化黃瓜，并獲得了插入突變體，為構(gòu)建黃瓜插入突變體庫(kù)、

4、研究黃瓜基因功能奠定重要基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化
　　在實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)上，通過Kan敏感試驗(yàn)，確定黃瓜栽培品種‘長(zhǎng)春密刺’抗性芽的最適篩選壓力為100 mg/L。通過改變培養(yǎng)基固化劑、添加抗氧化劑和有機(jī)添加物的方式，對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在脫乙酰吉蘭糖膠為固化劑的培養(yǎng)基上‘長(zhǎng)春密刺’的抗性芽誘導(dǎo)率比以瓊脂粉為固化劑的培養(yǎng)基誘導(dǎo)率

5、高28.21％;共培養(yǎng)基中添加50 mg/L抗氧化劑α-LA時(shí)，‘長(zhǎng)春密刺’抗性芽誘導(dǎo)率最高達(dá)66.67％，平均芽分化數(shù)最高達(dá)1.32;在選擇培養(yǎng)基中添加1.5 g/L的有機(jī)添加物CH，‘長(zhǎng)春密刺’抗性芽誘導(dǎo)率和平均芽分化數(shù)最高，分別為67.15％和1.42。綜上，本研究得到了以脫乙酰吉蘭糖膠為培養(yǎng)基固化劑，共培養(yǎng)基中添加50 mg/Lα-LA或選擇培養(yǎng)基中添加1.5 g/L CH的優(yōu)化的遺傳轉(zhuǎn)化體系，外植體抗性芽誘導(dǎo)高于實(shí)驗(yàn)室之前的研

6、究44.40％。
　　2.黃瓜T-DNA插入突變體的創(chuàng)制
　　以黃瓜栽培品種‘長(zhǎng)春密刺’子葉節(jié)為轉(zhuǎn)化外植體，采用優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，用T-DNA插入突變載體pROK2轉(zhuǎn)化黃瓜;使用PCR和斑點(diǎn)雜交方法鑒定T0和T1代轉(zhuǎn)化植株;以‘長(zhǎng)春密刺’未轉(zhuǎn)化植株為對(duì)照，調(diào)查統(tǒng)計(jì)T1代植株的表型。T0代PCR檢測(cè)結(jié)果初步證明了14S1、14S2兩個(gè)株系均整合了35S啟動(dòng)子和NPT-Ⅱ基因序列;T1代PCR檢測(cè)結(jié)果顯示14S1自

7、交后代55個(gè)單株中12個(gè)單株均擴(kuò)增出了35S和NPT-Ⅱ片段;以Dig標(biāo)記的35S和NPT-Ⅱ?yàn)樘结槍?duì)這12個(gè)單株及隨機(jī)選取剩余單株中的11株進(jìn)行斑點(diǎn)雜交檢測(cè)，得到14S1-27和14S1-34兩個(gè)單株有35s和NPT-Ⅱ雜交信號(hào);性狀調(diào)查統(tǒng)計(jì)顯示，T1代植株表型與對(duì)照植株沒有明顯的差異。綜合結(jié)果表明pROK2重組質(zhì)粒成功整合到了14S1株系的基因組中，對(duì)14S1自交后代的PCR檢測(cè)和斑點(diǎn)雜交檢測(cè)進(jìn)一步證明了14S1為轉(zhuǎn)化植株，確定14