水稻T-DNA插入突變體庫(kù)及其Enhancer trap 系的創(chuàng)建.pdf

1、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文水稻TDNA插入突變體庫(kù)及其Enhancertrap系的創(chuàng)建姓名：吳昌銀申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：張啟發(fā)20031101水稻TDNA插入突變體庫(kù)及其Enhancertrap系的創(chuàng)建中文摘要在植物功能基因組研究中，突變體對(duì)基因功能的闡釋具有重要作用。水稻是重要的糧食作物，由于其基因組較小、遺傳轉(zhuǎn)化體系成熟、精細(xì)的物理圖譜，積累了大量cDNA序列及全基因組測(cè)序框架圖的完成而成為禾本科作物研

2、究的模式植物。構(gòu)建水稻突變體庫(kù)對(duì)于水稻功能基因組研究具有重要的意義。Enhancertrap技術(shù)作為功能基因組研究的有力工具，它往往以T—DNA為載體將Enhancertrap元件隨機(jī)插入到植物基因組中創(chuàng)建植物Enhancertrap系，通過(guò)檢測(cè)不同Enhancertrap系中報(bào)告基因的表達(dá)模式來(lái)發(fā)掘新基因及其調(diào)節(jié)序列。本研究首次引入了一種帶有GAL4／VPl6UAS的Enhancertrap系統(tǒng)，運(yùn)用于水稻Enhancertrap系的

3、創(chuàng)建。本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，旨在構(gòu)建水稻TDNA插入的Enhancertrap突變體庫(kù)。該突變體庫(kù)正用于基因調(diào)節(jié)序列的分離，喪失功能突變體的篩選及作為基因表達(dá)的模式系創(chuàng)造獲得的功能的突變體。獲得的主要研究結(jié)果如下：1建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的粳稻品種“中花11號(hào)”和“中花15號(hào)”高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，抗性愈傷率為70％一80％，大約60％的抗性愈傷再生成植株。高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系為大規(guī)模創(chuàng)造水稻T—DNA插入突變體庫(kù)奠定了基礎(chǔ)。2總共獲得

4、兩個(gè)品種的34843個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化子，大約94％的轉(zhuǎn)化植株P(guān)CR檢測(cè)為陽(yáng)性，Southernblot結(jié)果表明，平均每個(gè)轉(zhuǎn)化子含有20個(gè)TDNA拷貝，估計(jì)水稻基因組中有65505個(gè)位點(diǎn)己被TDNA標(biāo)記。3組織化學(xué)檢測(cè)不同組織／器官(葉、葉鞘、穗軸、雄蕊、小穗軸、子房、稃、根等)表明，不同Enhancertrap系中報(bào)告基因GUS呈不同的表達(dá)模式，有的只在一個(gè)組織中表達(dá)，有的在多個(gè)組織中表達(dá)，有的在所有組織中均表達(dá)。4抽提葉片GUS為陽(yáng)性的En

5、hancertrap系中的葉片總RNA，RT—PCR結(jié)果顯示GAL4／VPl6基因均有表達(dá)。組織原位雜交證明GAL4／VPl6基因與BOGUS基因呈相同的表達(dá)模式，且BOGUS基因的表達(dá)量高，說(shuō)明該Enhancertrap系統(tǒng)在檢測(cè)基因表達(dá)上更為敏感。5Tl代家系GUS染色結(jié)果表明，大多數(shù)家系內(nèi)GUS基因表達(dá)的分離比例符合孟德爾3：1分離比，TI代GUS陽(yáng)性植株已被Southernblot所證實(shí)，Enhancertrap系中T—DNA及