橡膠樹炭疽病菌T-DNA插入突變體庫的構建及其分子研究.pdf

1、由膠孢炭疽和尖孢炭疽菌聯(lián)(復)合侵染引起的橡膠樹炭疽病是目前國內(nèi)天然橡膠生產(chǎn)上最為嚴重的葉部病害之一,危害逐年加重。炭疽病菌也是研究植物--病原互作的重要模式真菌。為開展炭疽病菌致病分子機制研究,我們在廣泛收集國內(nèi)橡膠樹主栽區(qū)炭疽病菌,明確其基礎生物學特性和分類地位,以及完成國內(nèi)主要種質(zhì)對膠孢和尖孢炭疽菌的抗病性評價的基礎上,通過優(yōu)化建立的農(nóng)桿菌介導遺傳轉(zhuǎn)化體系成功轉(zhuǎn)化膠孢炭疽菌菌株HCGHN4和尖孢炭疽菌菌株HCGYN12,并對轉(zhuǎn)化子

2、進行了表型篩選和分子分析。這為進一步確定和分離炭疽菌致病基因及其功能分析提供了研究材料。
　　 對來自不同地方的22個橡膠炭疽病菌rDNA-ITS區(qū)的5.8 S及兩側(cè)ITS序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),引起我國橡膠樹炭疽病的病原菌有尖孢炭疽和膠孢炭疽兩種;尖孢炭疽菌種內(nèi)遺傳變異較小,而膠孢炭疽菌種內(nèi)遺傳變異較大。
　　 開展了介導轉(zhuǎn)化體系的最適AS的濃度、共培養(yǎng)的時間、農(nóng)桿菌的誘導時間、農(nóng)桿菌的濃度、炭疽菌孢子濃度和共培養(yǎng)的溫度等影

3、響因子分析,獲得了適宜于橡膠樹膠炭疽菌炭疽菌的農(nóng)桿菌誘導遺傳轉(zhuǎn)化體系;并利用含具有氯嘧黃隆抗性標記的ILV1基因和報告基因GFP的二元載體pSULF.gfp,對橡膠樹炭疽病菌進行遺傳轉(zhuǎn)化,成功獲得膠孢炭疽菌T-DNA插入轉(zhuǎn)化子2172個和尖孢炭疽菌T-DNA插入轉(zhuǎn)化子2263個,轉(zhuǎn)化效率均達106個分生孢子＞300個轉(zhuǎn)化子。
　　 轉(zhuǎn)化子的特異引物PCR擴增結(jié)果表明,T-DNA標記已成功插入兩種橡膠樹炭疽病菌。隨機選取20個轉(zhuǎn)化

4、子進行Sotlthem雜交分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)膠孢炭疽菌9個為單拷貝,7個為雙拷貝,3個為三拷貝以上插入,另外1個轉(zhuǎn)化子的實驗沒有結(jié)果;尖孢炭疽菌8個單拷貝,7個雙拷貝,3個為三拷貝以上插入。兩菌株轉(zhuǎn)化子中,單拷貝轉(zhuǎn)化子約占比例為47.4％和44.4％。
　　 T-DNA的插入對兩種轉(zhuǎn)化子形態(tài)和生長速率有一定影響,但目前尚未篩選到產(chǎn)孢能力、侵染力和致病力發(fā)生明顯改變的突變體。進一步通過TAIL-PCR擴增獲得了HCGYN12-153、