柑橘酸腐病菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、酸腐病是除青綠霉病之外危害柑橘類果實重要的采后病害之一，目前國內(nèi)外已有的研究報道中關(guān)于其致病機理的研究甚少。本研究通過農(nóng)桿菌介導真菌遺傳轉(zhuǎn)化方式，建立酸腐病菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，從分子水平上研究其致病機理。主要以實驗室前期分離得到的柑橘酸腐病菌菌株(AY-1)為實驗受體菌株，通過農(nóng)桿菌介導法，將含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（neo）的T-DNA片段插入到受體菌基因組中。通過對影響轉(zhuǎn)化效率的各個條件的初步優(yōu)化，主要包括受體菌孢子濃度、共培養(yǎng)時間、共

2、培養(yǎng)溫度、承載膜等，構(gòu)建了柑橘酸腐病原菌遺傳轉(zhuǎn)化體系。經(jīng)過抗生素G418篩選和PCR鑒定，外源基因被成功插入到受體菌基因組中。主要的研究結(jié)果如下:
　　(1)為了建立病原菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，構(gòu)建了含neo基因的載體質(zhì)粒pTFCM-G418。
　　(2) AY-1對抗生素G418的敏感性檢測結(jié)果表明，當G418的濃度達到300μg/mL時能完全抑制住AY-1的生長，為了提高得到陽性轉(zhuǎn)化子的概率，確定1000μg/mL G418為最

3、終篩選濃度。
　　(3)通過對影響轉(zhuǎn)化效率的各個條件的初步探索，目前獲得的最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件是:受體菌AY-1孢子濃度為4×106(CFU/mL)，根癌農(nóng)桿菌AGL-1OD600為0.4左右，預培養(yǎng)中不添加AS誘導，25℃下在玻璃紙上培養(yǎng)48h。在此等條件下，轉(zhuǎn)化效率最高可得到60個突變子（每106個孢子）。
　　(4)在含有1000μg/mL G418的PDA上生長的待定轉(zhuǎn)化子，經(jīng)PCR鑒定均能擴增出目的基因，再連續(xù)繼5代培養(yǎng)之