艷果金絲桃再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究.pdf

1、艷果金絲桃(Hypericum androsaemum L．)屬藤黃科金絲桃屬，是一種兼具觀賞和藥用價值的花灌木。其花朵鮮黃色，果實紅色，觀賞價值極高，在園林綠化以及插花中廣泛應(yīng)用。但艷果金絲桃易受到線蟲和病原菌的侵害，使艷果金絲桃在自然界的生長受到影響，種質(zhì)下降。本研究在艷果金絲桃組培快繁和再生的基礎(chǔ)上，通過愈傷誘導(dǎo)再生和直接不定芽再生進(jìn)一步完善其再生體系，并在此基礎(chǔ)上，主要進(jìn)行了艷果金絲桃農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的研究，目標(biāo)是建立艷果金絲

2、桃遺傳轉(zhuǎn)化體系，為通過基因工程實現(xiàn)抗性新品種的培育奠定基礎(chǔ)。主要的研究結(jié)果如下：
　　 1．探討了艷果金絲桃愈傷組織誘導(dǎo)及再生體系以艷果金絲桃‘Hyp4’基因型的葉片為外植體，MS為基本培養(yǎng)基，探討了生長素(2,4-D，NAA，IAA，IBA)、細(xì)胞分裂素(6-BA，TDZ，KT)對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明：2，4-D對愈傷組織的誘導(dǎo)作用顯著，濃度在0.5mg/L-1.0mg/L時，愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到100％，IBA和NAA

3、處理下葉片外植體沒有愈傷形成；細(xì)胞分裂素6-BA，TDZ，KT單獨(dú)處理對愈傷組織誘導(dǎo)沒有顯著作用；在生長素和細(xì)胞分裂素結(jié)合，通過愈傷誘導(dǎo)率和愈傷質(zhì)量進(jìn)行分析，2，4-D與KT結(jié)合愈傷組織的誘導(dǎo)效果較好，其中MS+2，4-D(0.5mg/L)+KT(0.5mg/L)作用下愈傷誘導(dǎo)率高達(dá)到90%，愈傷量大。但總體比較愈傷分化能力較低。
　　 2．完善了艷果金絲桃直接不定芽再生體系在前期研究的基礎(chǔ)上，以‘Hyp3’基因型的葉片為外植體

4、，MS為基本培養(yǎng)基，比較了濾紙和AgNO3在再生過程中的作用，并進(jìn)一步研究了不同濃度的TDZ(0.05mg/L,0.1mg/L,0.3mg/L)和NAA(0.0mg/L,0.01mg/L,0.02mg/L,0.03mg/L)結(jié)合對葉片不定芽分化的影響。結(jié)果表明：1.0mg/LAgNO3在艷果金絲桃葉片不定芽再生中效果最好，再生率達(dá)到72.5%，在添加濾紙?zhí)幚硐略偕蕛H為12.5%。在激素研究中，TDZ對艷果金絲桃的葉片再生效果顯著，而隨

5、著NAA濃度的升高，再生率呈下降趨勢。在配方MS+TDZ(0.1mg/L)+NAA(0.0mg/L)+AgNO3(1.0mg/L)下，艷果金絲桃的再生率最高達(dá)到83.3%，平均再生芽數(shù)為3.8個，再生效果優(yōu)于之前配方。
　　 3．初步建立了艷果金絲桃農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系以艷果金絲桃‘Hyp3’基因型為試驗材料，對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)了探討。初步確立了艷果金絲桃不定芽再生的Km選擇壓為20.0mg/L，抑菌劑Cef的濃度為1

6、00.0mg/L。通過GUS瞬時表達(dá)和轉(zhuǎn)化后外植體生長狀態(tài)分析，研究了預(yù)培養(yǎng)時間、侵染時間、共培養(yǎng)、pH緩沖劑、抗氧化劑等對轉(zhuǎn)化的影響，初步得出了‘Hyp3’農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的基本條件：菌株EHA105，預(yù)培養(yǎng)時間0d，侵染時間5min.，共培養(yǎng)時間3d.，共培培養(yǎng)基為MS+TDZ(0.1mg/L)+NAA(0.01mg/L)+AS(40.0mg/L)+MES(2.0g/L)，選擇培養(yǎng)基為MS+TDZ(0.1mg/L)+NAA(0.0