棉花葉柄高效再生體系的建立與遺傳分析.pdf

1、利用遺傳工程技術(shù)改良棉花品種已經(jīng)取得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化法是棉花的主要遺傳轉(zhuǎn)化方法之一，然而目前棉花的生物技術(shù)的發(fā)展仍然存在著很多障礙，在棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)中存在體細(xì)胞胚胎發(fā)生的基因犁依賴性、棉花組織培養(yǎng)的低效性(耗時，耗工)、基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的復(fù)雜性(難重復(fù)，轉(zhuǎn)化率低)和轉(zhuǎn)基因棉花的農(nóng)藝性狀的變異等等，這些問題已經(jīng)成為棉花生物技術(shù)、棉花功能基因的驗證和棉花相關(guān)基因克隆等研究領(lǐng)域的障礙和瓶頸。本研究針對棉花組織培養(yǎng)中涉

2、及的主要問題，從棉花組織培養(yǎng)外植體的選擇、基因型限制的遺傳規(guī)律、適合組織培養(yǎng)的特種棉花材料選育等方面進(jìn)行初步研究，同時把棉花農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的遺傳轉(zhuǎn)化效率提高了2～3倍，轉(zhuǎn)基因周期縮短到6個月，轉(zhuǎn)化效率穩(wěn)定在30％，為棉花功能基因的快速鑒定與轉(zhuǎn)基因材料的創(chuàng)造提供了技術(shù)支撐。取得的主要研究結(jié)果如下： 大田葉柄組織培養(yǎng)體系的建立：通過大田棉株葉柄愈傷組織的誘導(dǎo)、胚性愈傷組織的分化、胚狀體的萌發(fā)等試驗，建立了CCRI24的葉柄組織培養(yǎng)體系

3、，與常用的無菌苗下胚軸組織培養(yǎng)體系相比，該體系培養(yǎng)周期和分化率均無顯著差異，其分化率穩(wěn)定在30％左右。同時解決了葉柄組織培養(yǎng)過程中愈傷組織難以分化為胚性愈傷組織、胚性愈傷組織比來源于無菌苗下胚軸的胚性愈傷組織更容易褐化的問題。①激素對褐化有一定的影響，調(diào)節(jié)激素的用量，也可以達(dá)到早出胚狀體的目的KT/6-BA組合中，6-BA的用量應(yīng)介于0.08～0.16mg·L-1之間較好，KT的用量在0.08～0.12mg.L-1效果較好；在KT/IA

4、A組合中，KT在0.08-0.12mg·L-1時，IAA用量在0.08～0.12mg.L-1正常胚狀體的比例較高；②培養(yǎng)基中氮源的配比是棉花新分化的胚性愈傷組織在繼代中出現(xiàn)褐化的主要原因，將MS培養(yǎng)基大量元素中KNO3的用量增加到3.04g·L-1，NH4NO3減少到0.66g·L-1有利于防止褐化。 棉花葉柄愈傷組織分化率的遺傳分析：通過研究發(fā)現(xiàn)，葉柄分化率分布符合正態(tài)分布，說明葉柄分化率受數(shù)量基因控制。利用主-多基因模型分析

5、發(fā)現(xiàn)：大田棉花葉柄的分化率主要受2對主基因控制。基因間存在加性、顯性、上位性，該性狀主基因遺傳率在74.68％～83.22％。說明利用育種手段可以選育出高分化率的材料。在控制分化率的基因中，也存在多基因效應(yīng)，多基因解釋的遺傳變異低，僅有10.47-16.78％。 葉柄分化率相關(guān)基因的QTLs定位：通過W10xTM-1組合的F2群體分子標(biāo)記，找到了27個多態(tài)性標(biāo)記，采用Mapmaker/Exp(Version3.0)數(shù)據(jù)分析軟件構(gòu)

6、建連鎖群，進(jìn)行分子標(biāo)記的連鎖群分析與位點排序，對檢測到的19個位點進(jìn)行分析，有12個位點進(jìn)入2個連鎖群(LOD≥3.0)，兩連鎖群分別包含5個和7個分子標(biāo)記。根據(jù)連鎖群長度從大到小順序?qū)Ω鬟B鎖群進(jìn)行命名為LG1、LG2，LG1連鎖群長度為194.3cM，LG2連鎖群長度為109.1cM，標(biāo)記間的最小遺傳距離為12.7cM，最大的遺傳距離為43.3cM。應(yīng)用復(fù)合區(qū)間作圖法共檢測到3個與分化率相關(guān)性狀的QTL(LOD≥2.5)，分布在2個連

7、鎖群上，解析8.4％～58.1％的表型變異。其中，1個貢獻(xiàn)率達(dá)到58.1％。另兩個貢獻(xiàn)率分別為14.4％和8.4％。 棉花葉柄組織培養(yǎng)特性：棉花不同部位的葉柄細(xì)胞在脫分化形成愈傷組織方面無顯著差異；在棉花植株生長發(fā)育的旺盛時期，即蕾期、盛蕾期、開花期、盛花期，植株不同部位、不同發(fā)育時期的葉柄愈傷組織的生長速度有一定的差異；胚性愈傷組織分化率沒有顯著差異。到了棉花生長發(fā)育的后期，隨著葉柄的衰老程度增加，誘導(dǎo)出的愈傷組織狀態(tài)發(fā)生改變

8、，生長緩慢，但仍有42.8％的分化率。說明葉柄是比較適合組織培養(yǎng)的外植體。 棉花葉柄遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立：葉柄和無菌苗下胚軸對卡那霉素的耐受性不同，在用作遺傳轉(zhuǎn)化外植體時抗生素篩選濃度不同，農(nóng)桿菌浸染和適宜抗生素篩選條件下，抗性愈傷組織的誘導(dǎo)率分別是84.3％和46.7％，而兩者抗性愈傷組織分化率分別是65.1％和71.8％，因此葉柄轉(zhuǎn)化率是51.8％，無菌苗下胚軸的轉(zhuǎn)化率是33.5％，利用葉柄作外植體的轉(zhuǎn)化效率是無菌苗下胚軸的1

9、.55倍。葉柄抗性愈傷組織誘導(dǎo)率高的原因也可能與葉柄橫截面面積大，與農(nóng)桿菌接觸的細(xì)胞多有關(guān)。 棉花高分化率材料的選育體系的建立與遺傳轉(zhuǎn)化：應(yīng)用葉柄組織培養(yǎng)體系，從CCRI24、冀合312、中394中選育出葉柄分化率≥80％的株系10個，其中有6株系的無菌苗下胚軸分化率也高達(dá)100％。選育的株系分化能力可以穩(wěn)定的遺傳給后代，解決了棉花組織培養(yǎng)研究中由于分化率不穩(wěn)定而使培養(yǎng)體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象。從而建成了一套穩(wěn)定的棉花組織培養(yǎng)體系。