10389.減毒沙門菌介導的hnp3基因在真核細胞內(nèi)表達及其抗菌活性研究

1、分類號密級UDC編號碩士學位論文減毒沙門菌介導的HNP3基因在真核細胞內(nèi)表達及其抗菌活性研究學位申請人：人：陳慧敏指導教師：師：李銀聚教授學科專業(yè)：業(yè)：生物化學與分子生物學學位類別：別：理學2014年4月I論文題目：論文題目：減毒沙門減毒沙門菌介導的菌介導的HNP3基因在基因在真核細胞真核細胞內(nèi)表達表達及其抗菌活性研究及其抗菌活性研究專業(yè)：業(yè)：生物化學與分子生物學生物化學與分子生物學研究生：生：陳慧敏陳慧敏指導教師：指導教師：李銀聚李銀

2、聚教授教授摘要鼠傷寒沙門菌是一種能夠在體內(nèi)多種組織定植的胞內(nèi)侵襲性細菌。經(jīng)消化道感染的鼠傷寒沙門菌可寄居在肝臟、腎臟、淋巴結(jié)和肺臟等組織器官，這種特性決定了鼠傷寒沙門菌可作為理想的外源基因的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，經(jīng)減毒的鼠傷寒沙門菌可作為理想的質(zhì)粒DNA運載載體。人α防御素3（HNP3）是一種陽離子抗菌肽，存在于哺乳動物的大部分組織器官中，是機體先天性免疫的重要組成部分。HNP3抗菌譜廣，對多數(shù)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、寄生蟲以及包膜病毒等

3、都有較強的殺滅作用。因此，針對HNP3開展分子結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)性研究具有重要的意義。本實驗根據(jù)HNP3的編碼序列設(shè)計3對引物，分別擴增HNP3的原前體肽（preproHNP3）、前體肽（proHNP3）和成熟肽（HNP3）基因片段，構(gòu)建原前體肽和成熟肽真核表達載體pcDNA(preproHNP3)和pcDNA(HNP3)及前體肽原核表達載體PYA(proHNP3)。然后將重組真核表達載體pcDNA(preproHNP3)和pcDNA(HN

4、P3)電轉(zhuǎn)化導入減毒沙門菌ΔcrpSL1344，重組原核表達載體PYA(proHNP3)電轉(zhuǎn)化入減毒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344，構(gòu)建重組菌?crpSL1344(pcDNApropreHNP3)、?crpSL1344(pcDNAHNP3)和?crp?asdSL1344(PYAproHNP3)。重組菌分別轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的BHK細胞，TricineSDSPAGE和Westernbloting檢測preproHNP3、HNP3和proHN

5、P3蛋白表達情況，ELISA檢測其表達水平，瓊脂板擴散法檢測表達的preproHNP3、HNP3和proHNP3的抗菌活性；在此基礎(chǔ)上，重組菌分別接種昆明白小鼠，于接種后第10d用沙門菌SL1344標準毒株和野生型大腸桿菌進行攻毒保護性試驗。結(jié)果顯示：重組菌?crpSL1344(pcDNApreproHNP3)、?crpSL1344(pcDNAHNP3)和?crp?asdSL1344(PYAproHNP3)在BHK細胞中分別有10.0k