gyrB基因在沙門菌屬分類鑒別中的應(yīng)用.pdf

1、沙門菌是一種革蘭陰性桿菌，具有鞭毛，兼性厭氧，能夠感染人類和動物，是引起食物中毒的主要病原菌。沙門菌可致多種疾病，輕者為自愈性胃腸炎，重者可引起致死性傷寒；沙門菌還能引起局部感染，此外還存在無癥狀的帶菌者。人類主要通過污染的食品和水源經(jīng)口感染沙門菌，沙門菌感染只有少數(shù)是爆發(fā)，大部分(大于80％)是散發(fā)病例；全世界每年有數(shù)百萬人感染沙門菌并且有數(shù)千人因此而死亡。沙門菌感染已經(jīng)成為人類健康的威脅，并給很多國家?guī)韲?yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。 沙

2、門菌屬是腸桿菌科細(xì)菌中最復(fù)雜的菌屬，家族龐大，所以其屬內(nèi)分類顯得尤為重要。Kauffman-White根據(jù)沙門菌的O抗原、H抗原和Vi抗原將沙門菌分為不同的血清型，按此分類標(biāo)準(zhǔn)，至今已發(fā)現(xiàn)2500多種血清型。所有血清型的沙門菌均能引起人類感染，但對動物卻有宿主選擇性。少數(shù)沙門菌只感染一種或幾種動物，例如傷寒沙門菌只能感染靈長類，都柏林沙門菌只感染牛，豬霍亂沙門菌僅感染豬；當(dāng)這些菌株感染人類的時候，往往是具有侵襲性的，甚至可威脅生命。然而

3、大多數(shù)血清型的沙門菌有廣泛的宿主。 根據(jù)DNA-DNA雜交結(jié)果，按親緣關(guān)系沙門菌被分為兩個種：腸炎沙門菌和邦戈?duì)柹抽T菌，每個菌種包括多種血清型。典型菌種腸炎沙門菌包括六個亞種：腸炎亞種Ⅰ型、薩拉姆亞種Ⅱ型、亞利桑那亞種Ⅲa型、第亞利桑那亞種Ⅲb型、豪頓亞種Ⅳ型、因迪卡亞種Ⅵ，邦戈?duì)柹抽T菌即為邦戈?duì)柹抽T菌亞種Ⅴ型。大多數(shù)(59％)血清型的沙門菌屬于Ⅰ型亞種(腸炎沙門菌腸炎亞種)，Ⅰ型亞種中最常見的血清型屬于A、B、C1、C2、D和

4、E群，這些血清型的沙門菌占人和溫血動物沙門菌感染的99％。腸炎沙門菌其它亞種和邦戈?duì)柹抽T菌多從冷血動物和環(huán)境中分離到，很少在人類感染中見到。 應(yīng)用PCR技術(shù)，通過分析基因序列，可以確定細(xì)菌的進(jìn)化關(guān)系和對細(xì)菌分類鑒定。常用的基因有16S/23SrRNA基因、管家基因和插入基因。16SrRNA基因普遍存在于各種細(xì)菌，細(xì)胞內(nèi)含量豐富，保守區(qū)相對穩(wěn)定，不發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，在特定生長情況下不發(fā)生適應(yīng)性突變，是細(xì)菌鑒定和分類的理想選擇，已成為目

5、前細(xì)菌分類鑒別的金標(biāo)準(zhǔn)。然而對于一些進(jìn)化距離相近的細(xì)菌，16SrRNA基因不能將其區(qū)分。 最近研究發(fā)現(xiàn)，蛋白編碼基因gyrB是細(xì)菌鑒定和分類的又一理想靶基因。gyrB編碼DNA解旋酶(gyrase)的B亞單位；細(xì)菌的解旋酶屬于Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶，由A、B兩種亞基組成活性單位A282。gyrB除了具備系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記的特征外，一個顯著的優(yōu)點(diǎn)是基因的進(jìn)化率較快，堿基替換頻率較高，能比16SrRNA基因序列更好地區(qū)分相似細(xì)菌，可用于細(xì)菌菌種水

6、平的鑒定。 本研究用PCR技術(shù)擴(kuò)增沙門菌的gyrB和16SrRNA基因序列，并測序；測序結(jié)果用于細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；通過與16SrRNA基因比較，評價gyrB基因在沙門菌屬分類鑒別中的應(yīng)用。 材料與方法 1.經(jīng)分離培養(yǎng)，形態(tài)學(xué)、手工生化、全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)和血清凝集鑒定，收集10株不同血清型的沙門菌。 2.提取細(xì)菌基因組DNA，PCR擴(kuò)增16SrRNA和gyrB基因序列，并測序。 3.將

7、測序結(jié)果與GenBank中的序列比對，并將測序得到的序列遞交到GenBank。 4.從GenBank獲得另外8株腸桿菌科細(xì)菌的16SrRNA和gyrB基因序列，與測序得到的序列一并用Clustalx軟件作多重序列比對。采用Kimura2-parametermodel計(jì)算進(jìn)化距離。 5.根據(jù)比對結(jié)果，用Mega2軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，計(jì)算方法為neighbor-joiningmethod，采用Bootstrap法評估進(jìn)化樹，

8、Replications數(shù)為1000。 結(jié)果 1.手工生化鑒定和全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)將沙門菌鑒定到屬的水平，血清凝集將沙門菌鑒定到血清型。 2.經(jīng)PCR擴(kuò)增并測序，獲得1.4kbp左右長度的16SrRNA基因序列和1.2kbp左右長度的gyrB序列。 3.6株沙門菌的16SrRNA基因和gyrB基因在GenBank中均存在序列；測序結(jié)果經(jīng)與GenBank中序列比對，gyrB比對結(jié)果為5株相符，1株不相符，而16S

9、rRNA有3株相符，2株不相符，1株不能確定。 4.將測序得到的10株沙門菌的16SrRNA基因序列和gyrB序列遞交到Genbank，生成以下序列號：DQ344530～DQ344539和DQ344540～DQ344549。5.多重序列比對結(jié)果表明：基于gyrB序列的細(xì)菌間的相似性低于基于16SrRNA基因的相似性；而基于gyrB序列的細(xì)菌間的進(jìn)化距離大于基于16SrRNA基因的進(jìn)化距離。 6.16SrRNA基因和gyr