Hfq對傷寒沙門菌高滲應(yīng)激早期的基因表達(dá)的調(diào)節(jié).pdf

1、目的：
　　 Hfq是細(xì)菌一種RNA分子伴侶，能夠調(diào)節(jié)細(xì)菌很多基因尤其是毒力相關(guān)基因的表達(dá)，在傷寒沙門菌中，細(xì)菌在高滲應(yīng)激條件下很多毒力相關(guān)基因表達(dá)改變。本研究的目的是探討傷寒沙門菌Hfq調(diào)節(jié)因子在高滲應(yīng)激條件下對基因表達(dá)的影響。
　　 方法：
　　 1.傷寒沙門菌hfq基因缺陷變異株制備。用自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組方法制備傷寒沙門菌hfq基因缺陷變異株。根據(jù)傷寒沙門菌hfq基因序列設(shè)計(jì)引物，并在引物5’-末端加上

2、需要的酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增hfq基因上、下游同源性片段，定向連接成hfq基因缺損型同源核苷酸片段，并與自殺質(zhì)粒pGMB151相連后，克隆至大腸埃希菌中，篩選陽性克隆，并對重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，將陽性重質(zhì)粒經(jīng)電擊法導(dǎo)入傷寒沙門菌野生株，進(jìn)行同源重組，用PCR觀察重組現(xiàn)象，將完全重組的菌株作為hfq基因的缺陷變異株，并通過相應(yīng)的核苷酸序列分析加以確定。
　　 2.全基因組芯片分析傷寒沙門菌轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜。利用傷寒沙門菌全基因組芯片分析技術(shù)，體

3、外模擬高滲環(huán)境應(yīng)激，在低滲(50 mmol/LNaCl)LB培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)傷寒沙門菌野生株和hfq基因缺陷變異株4h(37℃，250 rpm)至對數(shù)生長期，然后加入NaCl達(dá)到終濃度300 mmol/L(高滲)，繼續(xù)培養(yǎng)30 min后，分別提取野生株和hfq基因缺陷變異株的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA并標(biāo)記熒光(cy3或cy5)，與基因組芯片雜交，掃描后根據(jù)熒光信號(hào)分析各基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，比較傷寒沙門菌野生株和hfq基因缺陷變異株在高滲

4、應(yīng)激早期的基因表達(dá)譜差異。
　　 3.在傷寒沙門菌hfq缺陷變異株中回補(bǔ)hfq基因。根據(jù)傷寒沙門菌hfq基因序列設(shè)計(jì)引物，用PCR擴(kuò)增含啟動(dòng)子區(qū)域hfq基因，并將其與pBAD/gⅢ質(zhì)粒定向連接，篩選重組質(zhì)粒并進(jìn)行測序鑒定，將陽性重組質(zhì)粒經(jīng)熱擊法導(dǎo)入傷寒沙門菌hfq基因缺陷變異株，作為hfq基因回補(bǔ)株，同時(shí)用pBAD空質(zhì)粒導(dǎo)入傷寒沙門菌hfq基因缺陷變異株作為對照株。
　　 4.hfq-ompR雙缺陷菌株變異株制備。將含h

5、fq基因同源缺失片段的陽性重組自殺質(zhì)粒pGMB151用電擊法導(dǎo)入ompR缺陷菌株，進(jìn)行同源重組，用PCR觀察重組現(xiàn)象，將完全重組的菌株作為hfq-ompR雙缺陷菌株。
　　 5.qRT-PCR分析基因表達(dá)。選擇部分芯片分析顯示表達(dá)差異基因，設(shè)計(jì)并合成特異性引物，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)，驗(yàn)證芯片分析結(jié)果；設(shè)計(jì)tviA基因特異性引物，qRT-PCR分析傷寒沙門菌野生型菌株、hfq基因缺陷變異菌株和hfq基因回補(bǔ)菌株

6、分別在持續(xù)低滲、持續(xù)高滲和高滲應(yīng)激環(huán)境中tviA的表達(dá)，以探查不同環(huán)境下hfq對tviA的調(diào)節(jié)作用；并進(jìn)一步分析傷寒沙門菌野生型菌株、hfq基因缺陷變異菌株、ompR基因缺陷變異菌株和hfq-ompR雙缺陷菌株在高滲應(yīng)激下的tviA表達(dá)的變化，察看Hfq和OmpR對tviA的調(diào)節(jié)是否存在聯(lián)系。
　　 結(jié)果：
　　 1.PCR及序列分析證實(shí)，hfq基因缺陷變異株中hfq基因缺失了132bp，表明成功構(gòu)建hfq基因缺陷變異株

7、。
　　 2.基因表達(dá)譜比較分析結(jié)果表明傷寒沙門菌hfq基因缺陷變異株在高滲應(yīng)激早期有62個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，有32個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。這些基因主要涉及侵襲蛋白、外膜蛋白、代謝酶類和一些未知功能的推測蛋白。部分差異表達(dá)基因經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示與基因芯片表達(dá)譜分析結(jié)果一致。
　　 3.PCR及序列分析證實(shí)hfq基因回補(bǔ)菌株及hfq-ompR雙缺陷菌株制備成功。
　　 4.在高滲應(yīng)激下hfq基因缺陷變異株中tviA

8、表達(dá)上調(diào)，hfq基因回補(bǔ)菌株tviA表達(dá)與野生株接近，而在持續(xù)低滲和高滲條件下野生株和hfq基因缺陷變異株中tviA的表達(dá)水平相似。在高滲應(yīng)激下hfq-ompR雙缺陷菌株中的tviA的表達(dá)水平與hfq基因缺陷變異株中的基本一致。
　　 結(jié)論：
　　 Hfq在傷寒沙門菌高滲應(yīng)激條件下對基因表達(dá)調(diào)節(jié)及侵襲力的提高等發(fā)揮重要作用；傷寒沙門菌在高滲應(yīng)激后Hfq能抑制tviA基因的表達(dá)，而在穩(wěn)態(tài)高滲下沒有作用；傷寒沙門菌Hfq在高