傷寒沙門菌高滲誘導(dǎo)基因osmY的克隆表達(dá)與抗OsmY多克隆抗體的制備.pdf

1、目的:
　　 osmY基因是一種滲透壓誘導(dǎo)基因，編碼一種相對分子量約22×103周質(zhì)蛋白OsmY，其表達(dá)依賴于RpoS的激活，在高滲應(yīng)激的條件下，osmY基因的表達(dá)量可升高8～10倍，提示其在腸道菌應(yīng)答環(huán)境高滲應(yīng)激反應(yīng)中具有重要作用，因此本研究擬克隆表達(dá)重組蛋白OsmY-His6并制備兔抗重組蛋白的多克隆抗體，為進(jìn)一步研究OsmY蛋白在高滲應(yīng)激環(huán)境中所發(fā)揮的功能提供基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.pET22b(+

2、)-osmY重組質(zhì)粒的構(gòu)建:根據(jù)osmY基因兩端序列設(shè)計(jì)引物，以野生型S.Typhi野生株基因組DNA為模板，通過PCR獲得該基因DNA片段，酶切后與表達(dá)載體pET22b(+)連接，將重組體熱擊導(dǎo)入至E.coliJM109(DE3)中，篩選陽性質(zhì)粒，經(jīng)序列分析鑒定正確后，用IPTG誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá)重組蛋白OsmY-His6。
　　 2.重組蛋白OsmY-His6的純化:經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)菌超聲破菌，離心收集上清，利用Ni柱中的氯化

3、鎳可以與有His（組氨酸）標(biāo)簽的蛋白結(jié)合的原理來收集蛋白，用高濃度的咪唑沈脫OsmY-His6蛋白，利用透析袋去除咪唑，獲得純化的OsmY-His6蛋白，并用SDS-PAGE電泳鑒定蛋白的純度。
　　 3.兔抗重組蛋白的多克隆抗體制備:重組蛋白OsmY-His6與等體積的弗氏完全佐劑研磨至完全乳化，給每只家兔以1mL蛋白乳液（含50μg重組蛋白）背部皮下多點(diǎn)注射。以后，每隔兩周將抗原與等體積的弗氏不完全佐劑的乳液免疫家兔，共免疫

4、5次，末次免疫1周后頸動脈放血并獲得抗血清，分裝后保存于-20℃。用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測定抗體效價(jià)，用蛋白質(zhì)印跡法檢測多克隆抗體與抗原反應(yīng)的特異性。
　　 4.OsmY蛋白在不同時(shí)間高滲應(yīng)激下的變化分析:傷寒沙門菌在高滲條件下應(yīng)激不同時(shí)間(0、10、20、40、60、90、120、180min)，獲取細(xì)菌總蛋白，利用制備的抗OsmY多克隆抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)，觀察OsmY蛋白的變化情況。
　　 5.免疫共沉淀:傷寒沙門菌

5、在高滲條件下應(yīng)激不同時(shí)間(0、30min)，獲取細(xì)菌總蛋白，利用制備的抗OsmY多克隆抗體進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，觀察是否存在某一未知蛋白可與OsmY蛋白相結(jié)合。
　　 6.傷寒沙門菌野生株和osmY缺陷株在不同金屬離子應(yīng)激條件下的生長曲線測定:經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)OsmY蛋白可能是金屬離子結(jié)合蛋白，以生長時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線，對比傷寒沙門菌野生株和osmY缺陷株在CuSO4、CaCl2、MnCl2、NiS

6、O4應(yīng)激條件下生長情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.PCR及序列分析證實(shí)，成功構(gòu)建了表達(dá)載體pET22b(+)-osmY,熱擊導(dǎo)入至E.coliJM109(DE3)，用終濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)后，重組蛋白OsmY-His6獲得高表達(dá)。
　　 2.SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示，成功獲得了純度較高的重組蛋白OsmY-His6。
　　 3.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)和蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果表明，成功制備兔抗重組蛋

7、白OsmY-His6的多克隆抗體。
　　 4.蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果表明，傷寒沙門菌OsmY蛋白表達(dá)在高滲應(yīng)激后不斷遞增。
　　 5.免疫共沉淀結(jié)果表明，尚未發(fā)現(xiàn)某一未知蛋白可與OsmY蛋白相結(jié)合。
　　 6.生長曲線結(jié)果表明，在CuSO4、CaCl2、MnCl2、NiSO4應(yīng)激條件下，傷寒沙門菌野生株和osmY缺陷株的生長并無明顯差異。
　　 結(jié)論:
　　 成功克隆表達(dá)了傷寒沙門菌高滲誘導(dǎo)基因osmY