傷寒沙門菌體內(nèi)誘導表達基因的篩選鑒定.pdf

1、傷寒沙門菌是一種感染人的病原菌,能夠引起腹瀉、傷寒、淋巴結病、肝脾大、腦病、腸出血和腸穿孔等一系列疾病,2000年,全球估計發(fā)生傷寒病例2100萬例,其中約21萬人死亡。近年來,由于多重耐藥菌株的出現(xiàn),使得治療變得更加困難,迫切需要新的診斷、預防和治療方法。這些都需要對其致病機制的認識,但人是傷寒的唯一宿主,目前還沒有適合傷寒研究的動物模型,這給傷寒沙門菌致病機制的認識帶來很大困難,因而目前關于傷寒致病機理方面仍然有很多不清楚的環(huán)節(jié)。致

2、病菌的致病過程是與宿主細胞相互作用的復雜過程,需要許多致病基因的協(xié)調(diào)作用。致病菌在宿主體內(nèi)的環(huán)境與體外明顯不同,為了適應這種環(huán)境的變化,細菌會通過調(diào)節(jié)相應基因的表達作出適應性反應:下調(diào)非必須基因的表達,上調(diào)在宿主體內(nèi)存活中起關鍵作用的基因(例如獲得營養(yǎng)的基因和逃避宿主免疫的基因)以及表達那些感染宿主所必須的毒力基因。致病菌在宿主體內(nèi)表達而在體外不表達的這些功能基因稱為“體內(nèi)誘導基因”(in vivo-induced gene,ivi g

3、ene)。大量的研究表明,這些獨特的在體內(nèi)表達而在體外不表達的基因往往對病原菌在體內(nèi)的生存和致病有重要意義。本文利用“體內(nèi)誘導表達抗原技術”(in vivo-induced antigen technology,IVIAT)篩選傷寒沙門菌的ivi基因。其研究內(nèi)容和結果主要包括以下幾個方面:
　　 1.傷寒病人血清的收集與處理:收集初次就診并從未進行過抗傷寒藥物治療的傷寒病患者血清,挑選肥達反應效價較高的3個傷寒病人的血清,等體積

4、混合。首先用傷寒沙門菌Ty2、大腸桿菌BL21(DE3)全菌體吸附,然后再依次用細菌超聲裂解物和熱變性超聲裂解物吸附。每步吸附反應結束后,都取出10μl血清,以傷寒沙門菌超聲裂解物為抗原,ELISA檢查吸附效果。結果顯示隨著吸附步驟的進行,OD值越來越低,說明相應吸附血清中含有的針對傷寒沙門菌體外表達抗原的抗體越來越少,最后OD值穩(wěn)定在一定的水平,說明經(jīng)過吸附處理,血清中已經(jīng)幾乎不含有針對傷寒沙門菌體外抗原的抗體。
　　 2.表

5、達文庫的構建:表達文庫用pET-30abc表達系統(tǒng)構建。該系統(tǒng)由3個質(zhì)粒構成,一段基因組DNA插入到這三個表達載體后,能保證在可能出現(xiàn)的三種讀框中,至少有一種是符合實際序列讀框的,從而在誘導表達后獲得一個序列正確的蛋白質(zhì)或肽段。病原菌基因組DNA用Sau3AI進行不完全酶切,酶切產(chǎn)物凝膠電泳,取長度位于0.5～1.5 Kb區(qū)域的DNA片段純化,與預先用BamHI線性化的pET30abc載體DNA進行連接,連接產(chǎn)物電轉入感受態(tài)大腸桿菌DH

6、5α,接種含卡那霉素平板,收集轉化子并回收質(zhì)粒,再轉入大腸桿菌BL21(DE3)。最終獲得的基因組文庫總量達到6.0×104,90％以上的都是含有插入外源片段的重組質(zhì)粒,文庫總量達到要求所需數(shù)量。
　　 3.表達文庫的篩選:將上述電轉獲得的表達文庫菌液涂布含卡那霉素的LB平板上,使每個平板產(chǎn)生約400個菌落。待菌落長到針尖大小時,將其轉印到含卡那霉素和IPTG的LB平板上,經(jīng)37℃誘導5小時。再將平板放到盛有氯仿的搪瓷盤中,氯仿

7、蒸汽作用15min使菌落部分裂解。將裂解菌落吸附到NC膜上,再用10％脫脂奶粉液封閉過夜。將封閉好的NC膜依次與吸附后血清、辣根過氧化酶標記的羊抗人Ig抗體室溫下各反應1h,PBS-T(含0.5％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液)洗滌,ECL增強化學發(fā)光試劑盒檢測。X光片上明顯區(qū)別于淡色背景下的黑點所對應的菌落即為初步確定的陽性克隆。將初步確定的陽性克隆和只含pET-30空載體的大腸桿菌BL21(DE3)陰性對照菌同時接種含卡那霉素和IPTG的

8、LB平板,重復以上免疫篩選步驟,進一步確證。提取純化陽性克隆質(zhì)粒并測序,PCR克隆全基因,酶切連接到pET30a載體的5'NdeI和3'NotI限制性酶切位點,以只含pET-30a空載體的大腸桿菌BL21(DE3)陰性對照菌,重復以上免疫篩選步驟,進行第三次篩選。最后得到7個ivi基因,他們是bcfD(t0025),grxC(t3817),sapB(t1598),t3663,t3816,t1497和t3689,他們的功能涉及菌毛結構組成

9、,物質(zhì)運輸和代謝。
　　 4.RT-PCR驗證:LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)傷寒沙門菌Ty2,用TRIzol提取其總RNA,Rnase-Free Dnase I處理消除DNA后,以所篩選的7個ivi基因設計特異性引物進行RT-PCR擴增,并設立陽性對照。凝膠電泳檢測擴增結果顯示,t3689,6cfD,sapB,grxC和t3816這5個基因有電泳條帶,條帶位置基本與基因大小相符,說明它們在體外是有表達的;t3663和t1497這兩2個